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1、临床微生物实验室临床微生物实验室必须进行规范化操作必须进行规范化操作吴茂红吴茂红江西省临床检验中心江西省临床检验中心人类面临着微生物的挑战,要打赢这场战争不仅需要有经验的医生,还需要一支优秀的侦察队伍临床微生物检验队伍。临床细菌室规模和发展速度与10年或20年前相比已经发生了巨大的变化,但离CLSI(临床实验室标准化研究所)标准化文件要求还相差很远,基层细菌室必须进行规范操作革命才可能应对微生物向人类的挑战,才能适应临床的需要。标本采集标本运送标本分离细菌鉴定和药敏报告反馈全程质量控制参考参考CLSI文件从以下文件从以下7方面提出建议方面提出建议标本采集和运送的基本规范；培养前标本质量检测基本
2、规范；标本分离的基本规范；细菌鉴定基本规范；细菌药物敏感试验基本规范；实验室质量保证基本规范；细菌报告基本规范；一一.标本采集和运送标本采集和运送标本采集和运送是细菌培养成功的最最重要的关标本采集和运送是细菌培养成功的最最重要的关键键!但由于标本的采集和运送常有护士或医生或病人自己完成,所以也是最不容易做好的事情，而且不知道问题所在之处,检验人员不能直接控制其质量造成的后果是:临床医生最不能接受的问题临床医生最不能接受的问题:阳性率低、标本污染阳性率低、标本污染竹（木）签棉拭子因棉花含有的脂肪酸及竹或木签含有树脂和甲醛等对细菌生长的抑制作用而不适于细菌学标本的采集，建议使用塑料杆的藻酸盐或涤纶
3、拭子。棉花纤维棉花纤维+竹竹/木条木条抑抑菌菌区区是是因因为为：植植物物分分泌泌出出来来的的：脂脂肪肪酸酸；树树脂脂；福福尔尔马马林林氯气氯气 ，重金属与胶水的影响重金属与胶水的影响 美国与欧洲对实验室的新要求美国与欧洲对实验室的新要求NCCLSM40标标准准DIN58942标标准准推荐推荐COPANAmies运送培养基运送培养基多用途运送系统多用途运送系统需氧需氧+厌氧厌氧低低氧氧化化的的环环境境不会对标本不会对标本的微生物造成损害的微生物造成损害拭拭子子是是深深入入培培养养基基中中来来保保护护苛苛养养菌菌与与厌厌氧氧菌菌两面是以塑料密封两面是以塑料密封,不透水和漏不透水和漏气气减少污染和维
4、持缺氧环境减少污染和维持缺氧环境ASM2004流感嗜血杆菌在三种不同的运送基的存活率流感嗜血杆菌在三种不同的运送基的存活率1.痰标本的采集和运送痰标本的采集和运送1.标本采集时间：用抗生素前2.采集方法：自然咳痰：必须用请水漱口3次，应包括咽喉部，立即用力咳出痰，于灭菌容器中或输送培养基中。支气管镜或支气管毛刷:由医生采集，建议直接种入输送培养基2.泌尿标本泌尿标本采集与运送采集与运送1采集后的标本应立即送检。2采集时间：多数药物从尿道排泄，所以不管用哪种方法都应在用药前采集。应采集早晨第一次的尿。3.标本管不应含防腐剂和消毒剂。尿标本保存：室温下保存时间不得超过2h（夏季保存时间应适当缩短或
5、冷藏保存）4冷藏保存标本时间不得超过8h，但应注意冷藏保存的标本不能用于淋病奈瑟菌培养。泌尿标本泌尿标本4.采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴和男性的外生殖器包括包皮内，然后用清水冲洗。5.长期留置导尿管的患者应在更换新管时留取尿标本。6.做厌氧培养时应膀胱穿刺采集尿。3.分泌物分泌物1.对开放性病灶的采集：如眼结膜脓性分泌物、扁桃体、外耳道、手术后切口、导管治疗感染、瘘管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性病灶。应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧的分泌物，用灭菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的组织送检。2.闭锁性脓肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、腹腔脓肿、盆腔脓肿等，对封闭
6、的脓肿常采用穿刺或引流的的方法采样，应在用药前采集，应注意脓液的气味、性状、颜色注意厌氧菌存在的可能。不能及时送检应应用输送培养基。4.便标本便标本1.采集时间：腹泻患者应在用药前、急性期采集；沙门菌感染、肠热症应在2周内采；厌氧菌出现症状即采集。2.采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有脓血和黏液的部位的粪便2-3克，如液状粪便取絮状物盛于无菌的、密封的、不吸水的容器内或直接盛于增菌液或保存液中；对不易获得粪便患者及幼儿，可用直肠拭子采集后置保存液或输送培养基中送检。便标本便标本注意事项：虽然粪便标本本身含很多细菌但也要用无菌容器。在患者病情许可的条件下应在用药前采集标本。应床边接种或置输送培
7、养基送检。厌氧细菌（难辩梭菌）培养的标本应尽量减少与空气接触。5.厌培养标本厌培养标本1.痰标本的厌氧培养标本采集：必须用气管穿刺法获得痰液，从口腔吐出的痰标本不能用于厌氧培养。2.尿标本的厌氧培养标本采集：耻骨上膀胱穿刺获得尿标本可用于厌氧菌培养3便标本厌氧培养标本采集：可用排出的便做厌氧培养但也应少与空气接触。环甲膜穿刺6.血液及骨髓标本血液及骨髓标本1.采血时间：尽可能在用抗生素前，心内膜炎例外。2.采血量：采一次或采一瓶是错误的，至少应采一套2瓶，分需氧和厌氧。2瓶血量不少于16-20ml，先将10ml注入需氧瓶，再将剩余血采血注入厌氧瓶。3.采血方法：不要与血气和血沉标本一起采血；不
8、推荐血入瓶前换针头；不推荐静脉血直接入瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血。为什么强调血培养抽为什么强调血培养抽23套？套？有研究表明：单次一套血培养的阳性率为65%双次两套血培养的阳性率为80%三次三套血培养的阳性率为96%血液及骨髓标本血液及骨髓标本4.采血间隔：如第一次采集2套（4瓶）血培养标本，在以后的2-5天不必采血，但除外心内膜炎和导管相关性败血症。5.儿童：采血量是总血量的1%。6.延迟培养瓶处理:延迟培养瓶不要放冰箱或孵箱，放常温，尽早送往临床细菌室。7.皮肤消毒液推荐：建议先用70-80%异丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。抽血量和体重的关系抽血量和体重的关系2-340-60=
9、36.322012.8-36.3262.1-12.7241.1-211-220个/油镜或该菌占所见到细菌的50%,可推测是标本中的优势细菌.有了合格的标本是保证培养成功的重要条件，但如果没有适宜的分离培养基和培养环境同样不能获得好的结果，为此制定如下基本条例以保证致病细菌分离成功。三三.分离培养基本规范分离培养基本规范1.痰培养痰培养1.培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰琼脂或伊红美兰、或加MRSA显色琼脂。2培养环境：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、置5-7%CO2、35环境培养，其他培养基置35空气培养。3结核培养：罗氏鸡蛋斜面，每一标本种2支，37空气培养。2.尿标本尿标
10、本1培养基：5%羊血琼脂、中国兰或伊红美兰，或CP3尿致病菌分离显色琼脂。2.菌落计数：每个标本都要做，用加样器或定量接种环取样本20ul分别接种于上述培养基均匀涂布整个平皿，此日作菌落计数。3培养环境：35空气环境培养3.便培养便培养1培养基：中国兰或伊红美兰，沙门氏志贺氏琼脂（SS琼脂）或加沙门菌分离琼脂。2培养环境：35空气环境培养。3疑似伪膜性肠炎：5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面、梭状芽孢杆菌分离琼脂（CCFA）。5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面置35空气环境培养。CCFA置35厌氧环境培养。其他特殊肠道致病菌培养按国家CDC要求执行。4.脑脊液培养脑脊液培养1培养基：5%兔血巧克力琼脂、5
11、%羊血琼脂。2培养环境：35，5-10%CO2环境培养。5.分泌物培养分泌物培养1培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤。2培养环境：35空气环境培养。6.胆汁或胸水或腹水胆汁或胸水或腹水1培养基：如标本量大时可按血液培养方法直接取16-20ml分别种入需氧和厌氧培养瓶。如标本量有限，可接种5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤。2培养环境：35空气环境培养。四四.细菌鉴定规范操作细菌鉴定规范操作1.涂片染色一涂片染色：应具备最基本的两种染色技术，即革兰氏染色和抗酸染色。1.革兰染色：革兰染色报告必须包括染色反应或微生物种类和类别，描述物
12、种的形态或结构。如革兰染色见到革兰阳性球菌，呈葡萄状排列；又如革兰染色见到真菌小分生孢子及菌丝。伪膜性肠炎见革兰阳性粗大杆菌，芽胞呈卵圆形，位于菌体近极端。竹节状菌丝竹节状菌丝WBC吞噬革兰氏阳性球菌吞噬革兰氏阳性球菌涂片染色涂片染色2.抗酸染色：抗酸染色报告应显示找到或未找到或可疑抗酸杆菌三种结果，报告中应以加号体现标本中抗酸杆菌的存在量。如找到抗酸杆菌+；见到染色不典型抗酸杆菌+，建议再送标本。不能报告找到结核杆菌但可报告未找到结核杆菌2.趋向性鉴定试验趋向性鉴定试验革兰阳性球菌:触酶试验触酶试验:3%H2O2用30%的H2O2稀释10倍后使用，避光4度保存；试验时设立阳性和阴性对照；1分
13、钟内产生大量气泡为阳性。凝固酶试验凝固酶试验：采用商品试剂或EDTA抗凝的多个兔混合血浆；测定玻片法测定凝聚因子10秒钟即可观察结果；测定凝固酶需在37度3-4h，若阴性还应放置24h再观察结果。革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌:氧化酶试验氧化酶试验建议用纸片法保存比较方便；试剂配制：1%盐酸四甲基对苯二胺水溶液阳性：由粉红变为蓝紫色为阳性对照：铜绿假单孢菌ATCC27853+大肠埃希菌ATCC25922-3.血清学试验血清学试验肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认，基层细菌室应具备1-3项血清试剂。血清学鉴定血清学鉴定1.志贺氏菌多价和单价凝集血清：2.沙门氏菌多价和单价凝集血
14、清3.致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清4.耶尔森氏菌凝集血清4.真菌鉴定真菌鉴定1每一基层实验室必须开展真菌涂片，报告临床是否找到真菌；是否见到真菌菌丝；从形态辨别常见丝状真菌;区别曲菌或毛霉菌。2开展酵母样真菌分离培养，应具备最基本的沙保弱培养基或用显色培养基，鉴别白念和非白念，隐球菌等。3.有条件的实验室应开展非培养的鉴定方法，如-D葡聚糖的检测。念珠菌显色培养基念珠菌显色培养基CHROMagarCandida真菌概述真菌概述真菌的基本结构：菌丝和孢子真菌的基本结构：菌丝和孢子菌丝：有隔、无隔，形态菌丝：有隔、无隔，形态鹿角状菌丝鹿角状菌丝真菌丝真菌丝病原真菌鉴定的基本流程病原真菌鉴定的基
15、本流程临床临床标本标本PDA,SDA28度培养度培养不不能能生生长长鼻孢子菌、肺孢子菌、鼻孢子菌、肺孢子菌、马拉马拉色菌（厚皮除外）色菌（厚皮除外）芽孢芽孢关节孢子关节孢子念珠菌、隐球菌、念珠菌、隐球菌、红酵母等红酵母等毛孢子菌、地霉毛孢子菌、地霉等等有隔菌丝有隔菌丝无隔菌丝无隔菌丝担子菌、子囊担子菌、子囊菌、半知菌菌、半知菌接合菌等接合菌等区分酵母样或霉样菌落区分酵母样或霉样菌落厚膜孢子厚膜孢子关节孢子及菌丝关节孢子及菌丝芽生孢子芽生孢子五五.药敏试验的规范操作药敏试验的规范操作1.用用CLS指指南南推推荐荐的的KB药药敏敏标标准准进进行行常常规规药药敏敏试验判断。试验判断。2.根据根据CL
16、SI更新及时替换应用的标准。更新及时替换应用的标准。3.根根据据CLSI推推荐荐的的方方法法，开开展展重重要要耐耐药药菌菌的的检检测测，如如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。纸片扩散法纸片扩散法l操作步骤操作步骤制备接种物（制备接种物（0.5麦氏单位麦氏单位）接种（接种（15分钟内接种，涂抹均匀分钟内接种，涂抹均匀）在接种好的琼脂平板上贴加纸片在接种好的琼脂平板上贴加纸片孵育（孵育（15分钟内反转平板，分钟内反转平板，35C空气孵育空气孵育）苛养菌苛养菌5CO2孵育孵育判度结果和解释结果判度结果和解释结果AST纸片扩散法纸片扩散法l判读结果判读结果将游标卡尺置于反转的平板的背面，测量到最
17、接近的整将游标卡尺置于反转的平板的背面，测量到最接近的整数毫米数。平板应距离一个黑色不反光的背景数英寸，并用数毫米数。平板应距离一个黑色不反光的背景数英寸，并用反射光照明。反射光照明。如果是加血的琼脂培养基，则应在透射光照射下，打开如果是加血的琼脂培养基，则应在透射光照射下，打开培养皿盖，从上表面测量抑菌圈。培养皿盖，从上表面测量抑菌圈。如果被测菌是葡萄球菌或肠球菌，则应孵育如果被测菌是葡萄球菌或肠球菌，则应孵育24小时，再小时，再在透射光下分别观察苯唑西林或万古霉素的透明抑菌圈内有在透射光下分别观察苯唑西林或万古霉素的透明抑菌圈内有无耐甲氧西林或耐万古霉素菌落的微弱生长。无耐甲氧西林或耐万古
18、霉素菌落的微弱生长。ESBL初步筛选实验初步筛选实验头孢泊头孢泊肟肟10ugor头孢他啶头孢他啶30ug氨曲南氨曲南30ugor头孢噻肟头孢噻肟30ug头孢曲松头孢曲松30ug药敏药敏纸片纸片头孢泊肟抑菌圈头孢泊肟抑菌圈=17mm*头孢他啶抑菌圈头孢他啶抑菌圈=22mm氨曲南抑菌圈氨曲南抑菌圈=27mm头孢噻肟抑菌圈头孢噻肟抑菌圈=27mm头孢曲松抑菌圈头孢曲松抑菌圈4g/mlforE.coliandKlebsiellaspp.);NA,不适用不适用CLSIM100-S16;Table2A(M2,M7)不适用不适用Ceftriaxone头孢曲松127Cefotaxime头孢噻肟NANAAztr
19、eonam氨曲南122Ceftazidime头孢他美1*22*Cefpodoxime头孢泊肟稀释法(g/ml)纸片扩散法(mm)Drug可诱导的克林可诱导的克林霉素耐药霉素耐药(erm-介导介导)常规常规D试验试验:阳性阳性15 g红霉素红霉素纸片及纸片及2 g克克林霉素之间距林霉素之间距离为离为15-26.“DTest”阳性反应阳性反应2006强调强调mecA介导的葡萄球菌耐药的表型试验介导的葡萄球菌耐药的表型试验纸片扩散法纸片扩散法用头孢西丁用头孢西丁(CXDD30 g)纸片纸片金葡菌金葡菌其结果等于苯唑西林纸片其结果等于苯唑西林纸片(OXDD)结果。结果。CoNS结果优于苯唑西林纸片的结
20、果。结果优于苯唑西林纸片的结果。结果清晰，读起来比苯唑西林容易。结果清晰，读起来比苯唑西林容易。报告时仍写苯唑西林，而不写头孢西丁。报告时仍写苯唑西林，而不写头孢西丁。MIC试验试验仍用苯唑西林药。仍用苯唑西林药。常见耐药菌释意常见耐药菌释意产超广谱内酰胺酶菌株（ESBLs）耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）耐甲氧西林葡萄球菌（耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）MRS包括凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌。表示其对-内酰胺类药物，如青霉素类、-内酰胺/-内酰胺酶抑制剂复合物、头孢类、碳青霉烯类，可在体外显示活性但临床上无效。如果为产酶株，不管体外药敏如何，其对青霉素类、头孢菌素类、氨曲南耐药！
21、临床上不能使用这些药物。产超广谱内酰胺酶菌株（ESBLs）CLSI在表格的导言中在表格的导言中对对ESBL增加了警告增加了警告“Warning”条文条文六六.质量控制的规范化质量控制的规范化1药物敏感试验的质量控制：应包括30天的初始质量稳定测试；每周一次的常规质量控制；5天的纠控程序。2鉴定试剂质量控制：购入新的试剂；在更换批号；更换生产厂家；结果发生异常等情况时均应进行质量控制。3染色液质量控制：每天临床标本染色前应包括染色结果阳性和阴性的对照物及染色液污染的质量检查。质量控制内容质量控制内容4分离培养基：如血琼脂和巧克力，用肺炎链球菌、-溶血和草绿色溶血的链球菌、流感嗜血杆菌、等苛养细菌
22、的标准菌株或经标准化试剂已证实结果正确的菌株进行测试，判断其分离能力。5.培养箱温度的质量控制：每天第一个开箱和最后离开实验室均应对培养箱的温度作记录；CO2培养箱还应记录CO2的含量。质量控制内容质量控制内容6冰箱温度记录：按每一冰箱存放的物品不同设置不同的质控范围，特别对低温冰箱；每天记录一次。7自动化设备：按厂家提供的SOP文件进行质控；在设备软件升级或修改版本时均应进行质量控制程序。8.每一有权向临床发报告的实验室都应参加全国或省或市级质量控制活动。细细菌菌实实验验室室应应对对不不同同的的细细菌菌检检验验报报告告时时间间和和内内容容应应有有相相应应的的规规定定，并并告告诉诉临临床床各各
23、科科，依依此此可可防防止止不明原因的报告延迟不明原因的报告延迟应分两种报告形式：应分两种报告形式：1.危重感染报告危重感染报告:2.常规报告常规报告:七七.临床细菌室报告制度的规临床细菌室报告制度的规范范1.涂片报告涂片报告1.革革兰兰染染色色：危重报告30分钟报告。报告内容应包括染色反应、是细菌或真菌、细菌形态。有无细胞内吞嗜现象，有无菌丝。2.抗抗酸酸染染色色：报告抗酸染色阳性或阴性；菌量以加号表示。常规报告24h,危重报告1h2。2.血液和无菌体液培养的报告制度血液和无菌体液培养的报告制度细菌检验报告应实行三级报告制度！细菌检验报告应实行三级报告制度！第一级：培养液直接涂片结果；第一级：
24、培养液直接涂片结果；第二级：初步药敏结果和平皿菌落涂片结果；第二级：初步药敏结果和平皿菌落涂片结果；第三级：正式细菌鉴定和药敏报告。第三级：正式细菌鉴定和药敏报告。3.便培养便培养24小时可发出初始报告;72小时应报告药敏试验结果；根据检测范围报告检测结果，如未检测出沙门菌、志贺菌。错误报告:未见到致病菌4.尿培养尿培养可在24小时报告初始结果，包括菌落计数和可能细菌种类，如氧化酶阴性的革兰阴性杆菌；金黄色葡萄球菌等。5.痰培养痰培养24小时初始报告，报告内容包括痰标本是否合格，优势细菌，金葡菌、铜绿假单孢菌等特征明显细菌的鉴定结果。6.分泌物报告分泌物报告24h初始报告：有无细菌生长；革兰阳性或阴性细菌或特征明显的细菌名称；根据涂片结果推测致病菌。谢谢谢谢