《药物制剂的微生物学检测 PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《药物制剂的微生物学检测 PPT课件.ppt（43页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、药物制剂的微生物学检查第一节第一节 中药制剂的无菌检查中药制剂的无菌检查灭菌制剂与无菌制剂的概念灭菌制剂与无菌制剂的概念灭菌制剂与无菌制剂的概念灭菌制剂与无菌制剂的概念 灭菌制剂：灭菌制剂：灭菌制剂：灭菌制剂：系指采用某一物理、化学方法杀灭或除去所系指采用某一物理、化学方法杀灭或除去所系指采用某一物理、化学方法杀灭或除去所系指采用某一物理、化学方法杀灭或除去所有活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。有活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。有活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。有活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。无菌制剂：无菌制剂：无菌制剂：无菌制剂：系指采用某一无菌操作方法或技术制备的不
2、系指采用某一无菌操作方法或技术制备的不系指采用某一无菌操作方法或技术制备的不系指采用某一无菌操作方法或技术制备的不含任何活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。含任何活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。含任何活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。含任何活的微生物繁殖体和芽胞的一类药物制剂。无菌制剂包括：无菌制剂包括：无菌制剂包括：无菌制剂包括：注射用制剂，眼用制剂；植入型制剂；注射用制剂，眼用制剂；植入型制剂；注射用制剂，眼用制剂；植入型制剂；注射用制剂，眼用制剂；植入型制剂；创面用制剂；手术用制剂等直接注射于体内或直接用于创创面用制剂；手术用制剂等直接注射于体内或直接用于创创面用制剂；手术用
3、制剂等直接注射于体内或直接用于创创面用制剂；手术用制剂等直接注射于体内或直接用于创面、黏膜等的一类制剂。面、黏膜等的一类制剂。面、黏膜等的一类制剂。面、黏膜等的一类制剂。这些制剂必须保证不含活的微生物，否则注入人体将会这些制剂必须保证不含活的微生物，否则注入人体将会这些制剂必须保证不含活的微生物，否则注入人体将会这些制剂必须保证不含活的微生物，否则注入人体将会引起严重的事故。因此，在出厂、上市前都必须按药典规引起严重的事故。因此，在出厂、上市前都必须按药典规引起严重的事故。因此，在出厂、上市前都必须按药典规引起严重的事故。因此，在出厂、上市前都必须按药典规定的方法进无菌检查。定的方法进无菌检查
4、。定的方法进无菌检查。定的方法进无菌检查。一、无菌检验的基本原则一、无菌检验的基本原则n n1.1.1.1.严格进行无菌操作严格进行无菌操作严格进行无菌操作严格进行无菌操作 无菌检查应在环境洁净度无菌检查应在环境洁净度无菌检查应在环境洁净度无菌检查应在环境洁净度10 00010 00010 00010 000级下的局部洁净度级下的局部洁净度级下的局部洁净度级下的局部洁净度100100100100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严
5、格遵守无菌操作，防止徽生物污染。严格遵守无菌操作，防止徽生物污染。严格遵守无菌操作，防止徽生物污染。严格遵守无菌操作，防止徽生物污染。n n2.2.2.2.建立方法的验证建立方法的验证建立方法的验证建立方法的验证 进行药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明进行药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明进行药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明进行药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或所采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的
6、组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。n n3.3.3.3.相关试剂及培养条件相关试剂及培养条件相关试剂及培养条件相关试剂及培养条件 供试品检查时，使用的表面活性剂、中和剂或灭活剂，供试品检查时，使用的表面活性剂、中和剂或灭活剂，供试品检查时，使用的表面活性剂、中和剂或灭活剂，供试品检查时，使用的表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。将供试应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。将供试应证明其有效性及对微生物的生长和存活无
7、影响。将供试应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。将供试品分别接种于适合需氧菌、厌氧菌、霉菌生长的培养基中，品分别接种于适合需氧菌、厌氧菌、霉菌生长的培养基中，品分别接种于适合需氧菌、厌氧菌、霉菌生长的培养基中，品分别接种于适合需氧菌、厌氧菌、霉菌生长的培养基中，在适宜条件下培养，细菌培养温度为在适宜条件下培养，细菌培养温度为在适宜条件下培养，细菌培养温度为在适宜条件下培养，细菌培养温度为3030303037373737；霉菌、酵；霉菌、酵；霉菌、酵；霉菌、酵母菌培养温度为母菌培养温度为母菌培养温度为母菌培养温度为2323232328282828。n n4.4.4.4.正确采集样品正确采
8、集样品正确采集样品正确采集样品 无菌检验是对整体中部分样品进行随机抽检，来推断整无菌检验是对整体中部分样品进行随机抽检，来推断整无菌检验是对整体中部分样品进行随机抽检，来推断整无菌检验是对整体中部分样品进行随机抽检，来推断整体是否有菌的情况体是否有菌的情况体是否有菌的情况体是否有菌的情况(无菌或染菌无菌或染菌无菌或染菌无菌或染菌)。因此，在一批药品的无。因此，在一批药品的无。因此，在一批药品的无。因此，在一批药品的无菌检验中，取样数量愈少，染菌的检出率愈小；取样愈多，菌检验中，取样数量愈少，染菌的检出率愈小；取样愈多，菌检验中，取样数量愈少，染菌的检出率愈小；取样愈多，菌检验中，取样数量愈少，
9、染菌的检出率愈小；取样愈多，染菌的检出率愈大，该批药品通过无菌检验的几率愈小。染菌的检出率愈大，该批药品通过无菌检验的几率愈小。染菌的检出率愈大，该批药品通过无菌检验的几率愈小。染菌的检出率愈大，该批药品通过无菌检验的几率愈小。无菌检验时取样量和比例必须严格按规定执行。无菌检验时取样量和比例必须严格按规定执行。无菌检验时取样量和比例必须严格按规定执行。无菌检验时取样量和比例必须严格按规定执行。n n5.5.5.5.检查结果判断检查结果判断检查结果判断检查结果判断 需氧菌、厌氧菌及霉菌检查中任何一不符合者，则判供需氧菌、厌氧菌及霉菌检查中任何一不符合者，则判供需氧菌、厌氧菌及霉菌检查中任何一不符
10、合者，则判供需氧菌、厌氧菌及霉菌检查中任何一不符合者，则判供试品不合格。试品不合格。试品不合格。试品不合格。二、无菌检查的基本方法二、无菌检查的基本方法（一）一般注射剂的无菌检查 1.1.一般注射剂指本身不含有任何抗菌或抑菌成分，剂型为一般注射剂指本身不含有任何抗菌或抑菌成分，剂型为 水溶性药品的无菌检查。水溶性药品的无菌检查。2.2.包含需氧菌、厌氧菌和真菌三类微生物的检查。包含需氧菌、厌氧菌和真菌三类微生物的检查。3.3.方法：直接接种法方法：直接接种法 4.4.将供试品按量分别直接接种于适宜需氧菌、厌氧菌和真将供试品按量分别直接接种于适宜需氧菌、厌氧菌和真 菌生长繁殖的一定量培养基中。菌
11、生长繁殖的一定量培养基中。直接接种法图示直接接种法图示无抗菌无抗菌作用的作用的供试品供试品抽抽样样接种于培养基硫乙醇酸盐培养接种于培养基硫乙醇酸盐培养基及改良马丁培养基管基及改良马丁培养基管 培培养养细菌细菌 37 37 霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌 25 25 接接种种第二节第二节 药物的微生物限度检查药物的微生物限度检查n n 药物的微生物限度检查，是指非规定灭菌制剂（如口服药及外用药物）及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。n n 检验项目主要有：细菌总数、霉菌总数和控制菌检测。药典化学药制剂通则项下的微生物限度要求药典化学药制剂通则项下的微生物限度要求n n无菌检查：注射剂、植入剂
12、、冲洗剂。无菌检查：注射剂、植入剂、冲洗剂。n n无菌检查及微生物限度检查：软膏剂、眼用制剂、气无菌检查及微生物限度检查：软膏剂、眼用制剂、气雾剂、喷雾剂、散剂、耳用制剂、鼻用制剂、凝胶剂、雾剂、喷雾剂、散剂、耳用制剂、鼻用制剂、凝胶剂、乳膏剂。乳膏剂。n n微生物限度检查：粉雾剂、口服溶液剂、口服混悬剂微生物限度检查：粉雾剂、口服溶液剂、口服混悬剂 、口服乳剂、搽剂、洗剂、局部用片剂、酊剂、栓剂、口服乳剂、搽剂、洗剂、局部用片剂、酊剂、栓剂、糖浆剂、膜剂、贴剂、灌肠剂、糊剂、涂剂、涂膜剂糖浆剂、膜剂、贴剂、灌肠剂、糊剂、涂剂、涂膜剂 。n n原则性要求：丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂。原则性
13、要求：丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂。药典中药制剂通则项下的微生物限度要求药典中药制剂通则项下的微生物限度要求n n无菌检查：注射剂。无菌检查：注射剂。n n无菌检查及微生物限度检查：散剂、软膏剂、眼用制剂、无菌检查及微生物限度检查：散剂、软膏剂、眼用制剂、鼻用制剂、气雾剂鼻用制剂、气雾剂*、喷雾剂。、喷雾剂。n n微生物限度检查：丸剂、颗粒剂、片剂、锭剂、煎膏微生物限度检查：丸剂、颗粒剂、片剂、锭剂、煎膏 剂、胶剂、糖浆剂、合剂、滴丸剂、胶囊剂、酒剂、剂、胶剂、糖浆剂、合剂、滴丸剂、胶囊剂、酒剂、酊剂、流浸膏剂、浸膏剂、露剂、茶剂、栓剂、贴膏酊剂、流浸膏剂、浸膏剂、露剂、茶剂、栓剂、贴膏 剂
14、剂(贴剂贴剂)、凝胶剂、搽剂、洗剂、涂膜剂、凝胶剂、搽剂、洗剂、涂膜剂.n n不要求：膏药。不要求：膏药。二、口服及外用中药的微生物学检查二、口服及外用中药的微生物学检查n n口服制剂：细菌总数、霉菌总数、大肠杆菌和口服制剂：细菌总数、霉菌总数、大肠杆菌和活螨的检测活螨的检测n n外用药物：绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、破伤外用药物：绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌风梭菌n n一般眼科制剂：细菌总数、霉菌总数、绿脓杆一般眼科制剂：细菌总数、霉菌总数、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌菌、金黄色葡萄球菌 以上药物均不能检出致病菌！以上药物均不能检出致病菌！以上药物均不能检出致病菌！以上药物均不能检出致病菌
15、！实验方法实验方法（一）、蜜丸细菌总数测定一）、蜜丸细菌总数测定（二）、蜜丸霉菌总数测定（二）、蜜丸霉菌总数测定1、无菌条件下随机称取、无菌条件下随机称取10g蜜丸置研钵中逐渐加入蜜丸置研钵中逐渐加入100ml生理盐水研磨为生理盐水研磨为1：10药液，分别量取药液，分别量取9ml生理盐水置生理盐水置10ml 具塞刻度试管中，其中一支加入具塞刻度试管中，其中一支加入1：10药液药液1ml后稀后稀释为释为1：100后再取后再取1ml加入加入9ml生理盐水具塞刻度试管中生理盐水具塞刻度试管中药物稀释为药物稀释为1：1000。2、取、取10个干烤后玻璃平皿，其中个干烤后玻璃平皿，其中6个平皿，每个平皿
16、，每2个分别加个分别加入入1：10，1：100，1：1000药液各药液各1ml，然后加入，然后加入50普普通琼脂培养基、（通琼脂培养基、（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）氯化三苯基四氮唑）15ml做细做细菌培养；剩余的菌培养；剩余的4个平皿，每个平皿，每2个分别加入个分别加入1：10，1：100，药液各，药液各1ml共共4个，然后加入个，然后加入50虎红马丁培养基虎红马丁培养基15ml做霉菌培养，并立刻转动平板使药液与培养基充分混匀。做霉菌培养，并立刻转动平板使药液与培养基充分混匀。10个平板置个平板置37培养箱培养培养箱培养24h后并计数每个稀释度的后并计数每个稀释度的3个个平板的菌落均数。平
17、板的菌落均数。3 3 3 3、选选选选取菌落平均取菌落平均取菌落平均取菌落平均值值值值在在在在30-30030-30030-30030-300之之之之间间间间的平板作的平板作的平板作的平板作为为为为菌落菌落菌落菌落总总总总数数数数的的的的测测测测定范定范定范定范围围围围，将数得的菌落数乘以相，将数得的菌落数乘以相，将数得的菌落数乘以相，将数得的菌落数乘以相应应应应的稀的稀的稀的稀释释释释度得到度得到度得到度得到每克每克每克每克检测检测检测检测蜜丸中蜜丸中蜜丸中蜜丸中细细细细菌菌菌菌总总总总数。数。数。数。选选选选取霉菌菌落平均取霉菌菌落平均取霉菌菌落平均取霉菌菌落平均值值值值在在在在5-5-5
18、-5-50505050之之之之间间间间的平板作的平板作的平板作的平板作为为为为霉菌霉菌霉菌霉菌总总总总数的数的数的数的测测测测定范定范定范定范围围围围，将数得的菌，将数得的菌，将数得的菌，将数得的菌落数乘以相落数乘以相落数乘以相落数乘以相应应应应的稀的稀的稀的稀释释释释度得到每克度得到每克度得到每克度得到每克检测检测检测检测蜜丸中霉菌蜜丸中霉菌蜜丸中霉菌蜜丸中霉菌总总总总数。数。数。数。n n当仅有当仅有当仅有当仅有1 1 1 1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落个稀释级的菌落数符合上述规定
19、，以该级的平均菌落数数数数稀释倍数报告菌数。稀释倍数报告菌数。稀释倍数报告菌数。稀释倍数报告菌数。n n当同时有当同时有当同时有当同时有2 2 2 2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值而个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值而个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值而个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值而定。定。定。定。若比值若比值若比值若比值2,2,2,2,以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌落数；落数；落数；落数；若比值若比值若比值若比值2
20、 2 2 2但但但但5 5 5 5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌落数；告菌落数；告菌落数；告菌落数；当出现比值当出现比值当出现比值当出现比值5 5 5 5，或高稀释级的菌落数，或高稀释级的菌落数，或高稀释级的菌落数，或高稀释级的菌落数低稀释级的菌落数等低稀释级的菌落数等低稀释级的菌落数等低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的
21、重异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。新验证。新验证。新验证。高稀释级的菌落数高稀释级的菌落数 稀释倍数稀释倍数低稀释级的菌落数低稀释级的菌落数 稀释倍数稀释倍数比值比值菌落数报告规则菌落数报告规则例次例次例次例次菌落均数菌落均数比比值值菌落菌落总总数数/g/g或或/ml/ml报报告方式告方式/g/g或或/ml/ml稀稀释释倍数倍数1010-1-11010-2-21010-3-31 1136513651641642020-164001640016000160002 22760276029529546461.61.6377503775038000380003 32890
22、289027127160602.22.2271002710027000270004 4不可不可计计46504650513513-5130005130005100005100005 5272711115 5-2702702702706 6不可不可计计3053051212-30500305003100031000n n当各稀释级的平均菌落数均当各稀释级的平均菌落数均当各稀释级的平均菌落数均当各稀释级的平均菌落数均30303030个，以最低稀释级的平个，以最低稀释级的平个，以最低稀释级的平个，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。均菌落数乘以稀释倍数的值
23、报告菌数。均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。n n若各稀释级的平均菌落数均若各稀释级的平均菌落数均若各稀释级的平均菌落数均若各稀释级的平均菌落数均300300300300个，以最高稀释级的个，以最高稀释级的个，以最高稀释级的个，以最高稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。n若各稀释级的平均菌落数均若各稀释级的平均菌落数均若各稀释级的平均菌落数均若各稀释级的平均菌落数均不在不在30303030300300300300个个个个之间，一个之间，一个稀释度大于稀释度大于3003003003
24、00个，相邻另一个稀释度小于个，相邻另一个稀释度小于30303030个个个个，则以接，则以接近近30303030300300300300个个个个的的平均菌落数平均菌落数平均菌落数平均菌落数乘以稀释倍数乘以稀释倍数的值报告菌数。的值报告菌数。的值报告菌数。的值报告菌数。n n如各稀释级的平板均无菌落生长，或测定数在如各稀释级的平板均无菌落生长，或测定数在如各稀释级的平板均无菌落生长，或测定数在如各稀释级的平板均无菌落生长，或测定数在10101010个以下时，个以下时，个以下时，个以下时，报告菌数为报告菌数为报告菌数为报告菌数为10101010个。个。个。个。被检药物细菌、霉菌总数应在药典规定的限
25、量以内，被检药物细菌、霉菌总数应在药典规定的限量以内，被检药物细菌、霉菌总数应在药典规定的限量以内，被检药物细菌、霉菌总数应在药典规定的限量以内，否则为不合格。如中药浓缩丸、中成药片剂及西药片剂细否则为不合格。如中药浓缩丸、中成药片剂及西药片剂细否则为不合格。如中药浓缩丸、中成药片剂及西药片剂细否则为不合格。如中药浓缩丸、中成药片剂及西药片剂细菌数每克不得超过菌数每克不得超过菌数每克不得超过菌数每克不得超过1000100010001000个；中药蜜丸、小丸每克不得超过个；中药蜜丸、小丸每克不得超过个；中药蜜丸、小丸每克不得超过个；中药蜜丸、小丸每克不得超过1000010000100001000
26、0个。中药蜜丸、水丸霉菌数每克不得超过个。中药蜜丸、水丸霉菌数每克不得超过个。中药蜜丸、水丸霉菌数每克不得超过个。中药蜜丸、水丸霉菌数每克不得超过500500500500个；中个；中个；中个；中药浓缩丸霉菌数每克不得超过药浓缩丸霉菌数每克不得超过药浓缩丸霉菌数每克不得超过药浓缩丸霉菌数每克不得超过100100100100个。个。个。个。（二）致病菌检测（二）致病菌检测 阳性对照试验：阳性对照试验：阳性对照试验：阳性对照试验：供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为对照试验的加菌量为1010100 CFU100 CFU，方法同
27、供试品的控制，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验：阴性对照试验：阴性对照试验：阴性对照试验：取稀释液取稀释液10ml10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。照。阴性对照不得有菌生长。n n1 1大肠埃希菌的检查大肠埃希菌的检查 大肠埃希菌是人和动物肠道中寄生的正常菌群大肠埃希菌是人和动物肠道中寄生的正常菌群，随粪，随粪便排出体外，可直接或间接污染药物及药品生产的各个环便排出体外，可直接或间接污染药物及药品生产的各个环节。服用后有可能被粪便中存在的肠道致病菌或
28、寄生虫卵节。服用后有可能被粪便中存在的肠道致病菌或寄生虫卵等病原体感染。因此，大肠埃希菌被列为粪便污染指示菌，等病原体感染。因此，大肠埃希菌被列为粪便污染指示菌，是口服药品常规必检项目。是口服药品常规必检项目。（二）致病菌检测（二）致病菌检测大肠埃希菌检查程序大肠埃希菌检查程序大肠埃希菌检查程序大肠埃希菌检查程序 供试品（供试品（供试品（供试品（1:10稀释）稀释）稀释）稀释）供试液供试液供试液供试液10ml 不少于不少于不少于不少于100ml的乳糖胆盐增菌液的乳糖胆盐增菌液的乳糖胆盐增菌液的乳糖胆盐增菌液 371824h 取增菌液划线转种取增菌液划线转种取增菌液划线转种取增菌液划线转种 伊红
29、美兰琼脂平板（或麦康凯琼脂平板）伊红美兰琼脂平板（或麦康凯琼脂平板）伊红美兰琼脂平板（或麦康凯琼脂平板）伊红美兰琼脂平板（或麦康凯琼脂平板）阴性 菌落紫黑色、有金属光泽乳糖发酵、IMViC试验发酵乳糖产酸产气、MViC：+-n n（1 1 1 1）增菌）增菌）增菌）增菌 目的目的:抑制不需要的细菌生长，而有利于需检菌抑制不需要的细菌生长，而有利于需检菌的生长。培养基的生长。培养基:乳糖胆盐乳糖胆盐 (BL)(BL)培养基，作用培养基，作用:胆胆盐盐(或去氧胆酸钠或去氧胆酸钠)具有抑制革兰阳性细菌生长的具有抑制革兰阳性细菌生长的作用。作用。方法：方法：按该品种验证的方法将供试液按该品种验证的方法
30、将供试液10ml10ml接种接种至至100ml100ml的乳糖胆盐培养基中，的乳糖胆盐培养基中，37培养培养181824h24h，必要时可延至，必要时可延至48h48h。（2 2 2 2）分离培养：）分离培养：）分离培养：）分离培养：伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)(EMB)(EMB)或麦康凯琼脂（或麦康凯琼脂（或麦康凯琼脂（或麦康凯琼脂（MacCMacC）平板平板平板平板 将将上上述述培培养养液液划划线线接接种种于于伊伊伊伊红红红红美美美美蓝蓝蓝蓝琼琼脂脂平平板板或或麦麦康康凯凯琼琼脂脂平平板板，37培培养养181824h24h。若若平平板板上上无无菌菌落
31、落生生长长、或或生生长长的的菌菌落落与与下下表表所所列列的的菌菌落落形形态态特特征征不不符符，判判供供试试品品未未检出大肠埃希菌。检出大肠埃希菌。培培 养养 基基菌菌 落落 形形 态态伊伊红红美美蓝蓝琼琼脂（脂（EMBEMB平板）平板）呈呈紫紫黑黑色色、浅浅紫紫色色、蓝蓝紫紫色色或或粉粉红红色色，菌菌落落中中心心呈呈深深紫紫色色或或无无明明显显暗暗色色中中心心，圆圆形形，稍稍凸凸起起，边边缘缘整整齐齐，表表面面光光滑滑，湿湿润润，常常有有金属光泽。金属光泽。麦康凯琼脂麦康凯琼脂（MacC）鲜鲜桃桃红红色色或或微微红红色色，菌菌落落中中心心呈呈深深桃桃红红色色，圆圆形形，扁扁平平，边缘整齐，表面
32、光滑，湿润。边缘整齐，表面光滑，湿润。大肠埃希菌菌落形态特征大肠埃希菌菌落形态特征划线接种于伊红美蓝琼脂平板划线接种于伊红美蓝琼脂平板划线接种于伊红美蓝琼脂平板划线接种于伊红美蓝琼脂平板大肠埃希菌在麦康凯琼脂平板上大肠埃希菌在麦康凯琼脂平板上 发酵乳糖菌落发酵乳糖菌落 大肠埃希菌在伊红美蓝琼脂平板大肠埃希菌在伊红美蓝琼脂平板上的菌落特征上的菌落特征n n（3 3 3 3）纯培养、染色、镜检，观察染色性及形态）纯培养、染色、镜检，观察染色性及形态）纯培养、染色、镜检，观察染色性及形态）纯培养、染色、镜检，观察染色性及形态n n（4 4 4 4）生化反应）生化反应）生化反应）生化反应 主要是与主要
33、是与产气杆菌产气杆菌进行鉴别，大肠埃希菌与产气杆菌两进行鉴别，大肠埃希菌与产气杆菌两者在形态、染色性、菌落等方面十分相似。因此，须通过者在形态、染色性、菌落等方面十分相似。因此，须通过生化反应来鉴别。挑取可疑菌落做生化反应来鉴别。挑取可疑菌落做乳糖发酵试验和乳糖发酵试验和乳糖发酵试验和乳糖发酵试验和IMViCIMViC试验试验试验试验吲哚试验（吲哚试验（I I）、甲基红试验）、甲基红试验(M)(M)、V-PV-P试验试验(Vi)(Vi)和枸椽酸盐利用试验和枸椽酸盐利用试验(C)(C)试验。试验。结果：结果：大肠埃希菌为大肠埃希菌为大肠埃希菌为大肠埃希菌为+-+-+-+-产气杆菌则为产气杆菌则为
34、产气杆菌则为产气杆菌则为-+-+-+-+n n（5 5 5 5）结果报告）结果报告）结果报告）结果报告 完全符合以下结果：完全符合以下结果：革兰氏阴性无芽孢杆菌；革兰氏阴性无芽孢杆菌；乳糖乳糖发酵产酸产气；发酵产酸产气；IMViCIMViC试验反应为试验反应为+-+-。应判定为检出。应判定为检出大肠埃希菌。吲哚试验吲哚试验（I I）+-甲基红试验甲基红试验(M)(M)+-+-VPVP试验试验（ViVi）+-枸椽酸盐利用试验枸椽酸盐利用试验（C C）+-I-I-吲哚（吲哚（吲哚（吲哚（indolindolindolindol）试验）试验）试验）试验色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸吲哚吲哚吲哚吲哚玫瑰吲哚
35、玫瑰吲哚玫瑰吲哚玫瑰吲哚 吲哚试剂吲哚试剂吲哚试剂吲哚试剂 -+M -甲基红（methyl red）实验葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 甲基红 -葡萄糖丙酮酸 甲基红 +-+V -VP（Voges-Proskauer）试验葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 二乙酰红色化合物 +胍基化合物葡萄糖丙酮酸 乙酰甲基甲醇 -+C -枸橼酸盐利用（枸橼酸盐利用（citrate utilizationcitrate utilization）试验）试验利用枸橼酸盐生长 +不能利用 -+第三节第三节 药物的抗菌试验药物的抗菌试验 药物的抗菌试验目的是为了检查药物的抗菌药物的抗菌试验目的是为了检查药物的抗菌药物的抗菌试验目的是
36、为了检查药物的抗菌药物的抗菌试验目的是为了检查药物的抗菌能力，包括药物的抑菌试验和杀菌试验。能力，包括药物的抑菌试验和杀菌试验。能力，包括药物的抑菌试验和杀菌试验。能力，包括药物的抑菌试验和杀菌试验。一般一般一般一般先进行体外抗菌试验，再进行体内抗菌试验。先进行体外抗菌试验，再进行体内抗菌试验。先进行体外抗菌试验，再进行体内抗菌试验。先进行体外抗菌试验，再进行体内抗菌试验。该项试验方法该项试验方法该项试验方法该项试验方法 已广泛应用于新药研究和指导临已广泛应用于新药研究和指导临已广泛应用于新药研究和指导临已广泛应用于新药研究和指导临床用药。床用药。床用药。床用药。(一)体外抑菌试验 n n1.
37、1.连续稀释法连续稀释法 用于测定药物的用于测定药物的用于测定药物的用于测定药物的最小抑菌浓度最小抑菌浓度最小抑菌浓度最小抑菌浓度(minimal inhibitory(minimal inhibitory concentrationconcentration，MICMIC),),MICMIC是指药物能抑制细菌生长的是指药物能抑制细菌生长的是指药物能抑制细菌生长的是指药物能抑制细菌生长的最高稀释度，以最高稀释度，以最高稀释度，以最高稀释度，以 g/mlg/ml或或或或U/mlU/ml表示，数值愈小，药物的抑表示，数值愈小，药物的抑表示，数值愈小，药物的抑表示，数值愈小，药物的抑菌作用愈强。菌作
38、用愈强。菌作用愈强。菌作用愈强。n n（1 1）液体培养基稀释法：）液体培养基稀释法：在试管中用液体培养基进行在试管中用液体培养基进行在试管中用液体培养基进行在试管中用液体培养基进行2 2 2 2倍系列稀释药物倍系列稀释药物倍系列稀释药物倍系列稀释药物 在每管在每管在每管在每管中加等量的试验菌液中加等量的试验菌液中加等量的试验菌液中加等量的试验菌液 1616161624h24h24h24h培养培养培养培养观察结果，以能抑观察结果，以能抑观察结果，以能抑观察结果，以能抑制试验菌生长的最低浓度（最高药物稀释度）为该药的制试验菌生长的最低浓度（最高药物稀释度）为该药的制试验菌生长的最低浓度（最高药物
39、稀释度）为该药的制试验菌生长的最低浓度（最高药物稀释度）为该药的MICMICMICMIC。管号管号抗生素原浓度抗生素原浓度（g/mlg/ml）抗生素来源管号抗生素来源管号取药体取药体积积(ml)(ml)CAMHBCAMHB体积（体积（ml)ml)抗生素最终抗生素最终浓度浓度（g/mlg/ml）LogLog2 21 15120(5120(原液原液)原液原液1 19 95125129 92 25125121 1号管（最终浓度，下同）号管（最终浓度，下同）1 11 12562568 83 35125121 1号管号管1 13 31281287 74 45125121 1号管号管1 17 764646
40、 65 564644 4号管（最终浓度，下同）号管（最终浓度，下同）1 11 132325 56 664644 4号管号管1 13 316164 47 764644 4号管号管1 17 78 83 38 88 87 7号管（最终浓度，下同）号管（最终浓度，下同）1 11 14 42 29 98 87 7号管号管1 13 32 21 110108 87 7号管号管1 17 71 10 011111 11010号管（最终浓度，下号管（最终浓度，下同）同）1 11 10.50.5-1-112121 11010号管号管1 13 30.250.25-2-213131 11010号管号管1 17 70.1
41、250.125-3-3 液体培养基稀释法药敏试验的抗生素溶液稀释方案液体培养基稀释法药敏试验的抗生素溶液稀释方案n n 判断抑菌还是杀菌，应将未长菌的试管内培养液再移判断抑菌还是杀菌，应将未长菌的试管内培养液再移判断抑菌还是杀菌，应将未长菌的试管内培养液再移判断抑菌还是杀菌，应将未长菌的试管内培养液再移种于琼脂平板上，如重新长出试验菌，表明该浓度只是抑种于琼脂平板上，如重新长出试验菌，表明该浓度只是抑种于琼脂平板上，如重新长出试验菌，表明该浓度只是抑种于琼脂平板上，如重新长出试验菌，表明该浓度只是抑菌浓度。药物的抑菌或杀菌作用是在一定条件下相对而言菌浓度。药物的抑菌或杀菌作用是在一定条件下相对
42、而言菌浓度。药物的抑菌或杀菌作用是在一定条件下相对而言菌浓度。药物的抑菌或杀菌作用是在一定条件下相对而言的，这与用药时培养基的组成、的，这与用药时培养基的组成、的，这与用药时培养基的组成、的，这与用药时培养基的组成、pHpHpHpH及所用的菌种、菌量等及所用的菌种、菌量等及所用的菌种、菌量等及所用的菌种、菌量等因素有关，所以必须严格控制试验菌、培养基等试验条件。因素有关，所以必须严格控制试验菌、培养基等试验条件。因素有关，所以必须严格控制试验菌、培养基等试验条件。因素有关，所以必须严格控制试验菌、培养基等试验条件。液体培养基稀释法测定药物的最小抑菌浓度液体培养基稀释法测定药物的最小抑菌浓度液体
43、培养基稀释法测定药物的最小抑菌浓度液体培养基稀释法测定药物的最小抑菌浓度(MIC)(MIC)(MIC)(MIC)液体培养基稀释法测定最小抑菌浓度（液体培养基稀释法测定最小抑菌浓度（液体培养基稀释法测定最小抑菌浓度（液体培养基稀释法测定最小抑菌浓度（MICMICMICMIC）通过平板培养证实）通过平板培养证实）通过平板培养证实）通过平板培养证实最小杀菌浓度（最小杀菌浓度（minimal bactericidal minimal bactericidal concentrationconcentration，MBCMBC）n n按液体培养基稀释法操作测出药物的按液体培养基稀释法操作测出药物的按液体
44、培养基稀释法操作测出药物的按液体培养基稀释法操作测出药物的MICMICMICMIC，将未长，将未长，将未长，将未长菌的各管培养液分别移种到无菌平板上，培养后菌的各管培养液分别移种到无菌平板上，培养后菌的各管培养液分别移种到无菌平板上，培养后菌的各管培养液分别移种到无菌平板上，培养后以无细菌生长的最低药物浓度（最高药物稀释度）以无细菌生长的最低药物浓度（最高药物稀释度）以无细菌生长的最低药物浓度（最高药物稀释度）以无细菌生长的最低药物浓度（最高药物稀释度）作为该药物的作为该药物的作为该药物的作为该药物的MBCMBCMBCMBC。n n（2 2 2 2）固体培养基稀释法：）固体培养基稀释法：）固体
45、培养基稀释法：）固体培养基稀释法：1 1 1 1）平板法：）平板法：）平板法：）平板法：方法：将不同浓度的药液按方法：将不同浓度的药液按方法：将不同浓度的药液按方法：将不同浓度的药液按1 1 1 19 9 9 9混入尚未凝固的琼脂培混入尚未凝固的琼脂培混入尚未凝固的琼脂培混入尚未凝固的琼脂培养基中养基中养基中养基中 制作成含有递减浓度药物的琼脂平板制作成含有递减浓度药物的琼脂平板制作成含有递减浓度药物的琼脂平板制作成含有递减浓度药物的琼脂平板将定量将定量将定量将定量的菌液点种法逐个点种于平板的菌液点种法逐个点种于平板的菌液点种法逐个点种于平板的菌液点种法逐个点种于平板 37373737培养培养
46、培养培养24h 24h 24h 24h 测得各测得各测得各测得各种细菌对药物的种细菌对药物的种细菌对药物的种细菌对药物的MICMICMICMIC。应用：测定多种细菌对同一药物的应用：测定多种细菌对同一药物的应用：测定多种细菌对同一药物的应用：测定多种细菌对同一药物的MICMICMICMIC；各种药物的抗菌活性测定；各种药物的抗菌活性测定；各种药物的抗菌活性测定；各种药物的抗菌活性测定；新抗菌药物的筛选。新抗菌药物的筛选。新抗菌药物的筛选。新抗菌药物的筛选。优点：不受药物颜色及浑浊度的影响，且手续简便。优点：不受药物颜色及浑浊度的影响，且手续简便。优点：不受药物颜色及浑浊度的影响，且手续简便。优
47、点：不受药物颜色及浑浊度的影响，且手续简便。n n2 2 2 2）斜面法：）斜面法：）斜面法：）斜面法：方法：将不同递减浓度的药液方法：将不同递减浓度的药液方法：将不同递减浓度的药液方法：将不同递减浓度的药液混入未凝固的装有琼脂混入未凝固的装有琼脂混入未凝固的装有琼脂混入未凝固的装有琼脂培养基的试管中培养基的试管中培养基的试管中培养基的试管中制成斜面制成斜面制成斜面制成斜面接种定量的试验菌液接种定量的试验菌液接种定量的试验菌液接种定量的试验菌液培养培养培养培养测知测知测知测知MIC MIC MIC MIC（g/mlg/mlg/mlg/ml）。）。）。）。应用：适用于必须较长时间培养的试验菌应用
48、：适用于必须较长时间培养的试验菌应用：适用于必须较长时间培养的试验菌应用：适用于必须较长时间培养的试验菌(如结核杆菌如结核杆菌如结核杆菌如结核杆菌)或避免孢子飞扬污染环境的霉菌。或避免孢子飞扬污染环境的霉菌。或避免孢子飞扬污染环境的霉菌。或避免孢子飞扬污染环境的霉菌。n n2.2.琼脂扩散法琼脂扩散法 原理：是利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓原理：是利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓原理：是利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓原理：是利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范围内抑制细菌生长，形成无菌生长的透明圈即为抑菌度范围内抑制细菌生长，形成无菌生长的透明圈即为抑菌度范围内抑制
49、细菌生长，形成无菌生长的透明圈即为抑菌度范围内抑制细菌生长，形成无菌生长的透明圈即为抑菌环。抑菌环的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并环。抑菌环的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并环。抑菌环的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并环。抑菌环的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的与该药对测试菌的与该药对测试菌的与该药对测试菌的MICMICMICMIC呈负相关关系（抑菌环越大，呈负相关关系（抑菌环越大，呈负相关关系（抑菌环越大，呈负相关关系（抑菌环越大，MIC MIC MIC MIC 越小）。越小）。越小）。越小）。方法：在琼脂平板上方法：在琼脂平板上方法：在琼脂平板上方
50、法：在琼脂平板上接种（涂布法或倾注法）试验菌接种（涂布法或倾注法）试验菌接种（涂布法或倾注法）试验菌接种（涂布法或倾注法）试验菌加药于平板上加药于平板上加药于平板上加药于平板上培养培养培养培养1818181824h24h24h24h观察测量抑菌环直径，观察测量抑菌环直径，观察测量抑菌环直径，观察测量抑菌环直径，或抑菌范围的大小或抑菌范围的大小或抑菌范围的大小或抑菌范围的大小评价药物抗菌作用的强弱。评价药物抗菌作用的强弱。评价药物抗菌作用的强弱。评价药物抗菌作用的强弱。应用：应用：应用：应用：用于定性试验；用于定性试验；用于定性试验；用于定性试验；初步判断药物的抗菌作用的大小。初步判断药物的抗菌