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1、实验实验六六 血清血清甘油三甘油三酯与胆固醇的与胆固醇的测定定酶法法测定血清中的甘油三定血清中的甘油三酯一一.目的要求目的要求了解血清甘油三酯酶法测定的原理了解血清甘油三酯测定的临床意义掌握酶标仪测定法的原理和操作二二实验原理原理血清甘油三酯的测定是血脂分析的重要内容之一。目前，国内多数医院采用酶法测定。酶法又分为：一步终点比色法和两步终点比色法。两步法的主要优点是消除了游离甘油的干扰。脂蛋白脂肪酶（LPL）可将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。甘油在甘油激酶催化下，生成磷酸甘油，后者在磷酸甘油氧化酶（GPO）催化下，生成磷酸二羟丙酮和H2O2。H2O2在过氧化物酶（POD）催化下与4-氨基安替比林
2、（4-AAP）及ESPAS（3-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺）反应生成紫色醌亚胺染料。形成的醌亚胺染料色泽强度与样品中甘油三酯的含量成正比。测定标准样品溶液和待测血清样品反应生成的醌亚胺染料吸光度（A）值，即可求出待测血清样品中甘油三酯的浓量。二二实验原理原理反应如下：甘油三酯（甘油三酯（TG）3H2O甘油甘油ATP甘油甘油-1-磷酸磷酸O2 H2O2 4-AAP ESPAS目前，TG测定试剂盒多根据以上原理配制，用一步终点法测定。甘油甘油3RCOOH（脂肪酸）（脂肪酸）甘油甘油-1-磷酸磷酸ADP磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮H2O2醌亚胺醌亚胺 染料染料 4H2O LPL三器材及三器材
3、及试剂1器材：器材：酶标仪，酶标板，37度恒温箱，移液枪。2.试剂：一一步步法法：Tris-HCl缓冲液（pH7.6，浓度为150mmlo/L），LPL或脂肪酶（3000u/L），甘油激酶（GK）（250u/L），ATP（0.5mmol/L），磷酸甘油氧化酶（GPO）（3000u/L），过氧化物酶（POD；辣根）（1000u/L），胆酸钠（3.5mmol/L），硫酸镁（17.5mmol/L），4-氨基安替比林（4-AAP）（1mmol/L），4-氯酚（3.5mmol/L），Triton X-100（0.1g/L）。四四操作步操作步骤取酶标条1个（每个样品2个重复），按下表操作：试剂（试剂（ul
4、）空白管空白管标准管标准管测定管测定管蒸馏水蒸馏水32.26mmol/L标准品标准品(TG)3样本样本3酶试剂（工作液）酶试剂（工作液）30030030037保温5min，空白调零，550nm处测定各孔A值。五五计算算（标准液浓度（标准液浓度=2.26mmol/L）（mmol/L）正常参考值：正常参考值：0.561.7mmol/L，老年约为：，老年约为：2.26mmol/L。美国国家胆固醇教育计划对空腹美国国家胆固醇教育计划对空腹TG水平分解线的修订意见为（水平分解线的修订意见为（1993年）：年）：TG正常：正常：4.5mmol/L胰腺炎高危：胰腺炎高危：11.3mmol/L六六注意事注意事
5、项试剂出现红色不能再用，试剂空白吸光度A550nm0.05；两步法37 4分钟能完全排除游离甘油；GPO纯度不高时，因其它氧化酶的存在而产生额外的H2O2，使得结果偏高；温度控制、吸量的准确度对结果影响较大；甘油三酯增高常见于肥胖、糖尿病、肾病综合症、糖原沉积症、高血压、冠心病等，也随年龄而上升。降低多见于甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能低下、肝功能严重低下。七七临床意床意义u 血脂血脂是血浆所含脂类的统称是血浆所含脂类的统称血浆所含脂类统称血脂，包括：甘油三酯、磷脂、胆固醇及其酯以及游离脂酸。外源性从食物中摄取 内源性肝、脂肪细胞及其他组织合成后释放入血n定义：n来源：血脂含量受膳食、年龄、性
6、别、职业及代谢等的影响，波动范围很大。七七临床意床意义十二指肠下段及空肠上段。十二指肠下段及空肠上段。中链及短链脂酸构成的TG 乳化 吸收 脂肪酶 甘油+FFA 门静脉 血循环肠粘膜 细胞 u 饮食饮食脂肪在小肠被吸收脂肪在小肠被吸收n吸收部位：n吸收方式：七七临床意床意义消化吸收和内源性合成的脂酸，以游离的形式存在较少，大多数以酯化的形式存在于甘油三酯之中而存在于体内。（二）甘油三（二）甘油三酯的主要作用是的主要作用是为机体提供能量机体提供能量（一）甘油三（一）甘油三酯是脂酸的主要是脂酸的主要储存形式存形式1.甘油三酯是机体重要的能量来源2.甘油三酯是机体的主要能量储存形式男性：21%，女性
7、：26 1g TG=38kJ七七临床意床意义（三）甘油三酯是3分子长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。甘油三酯是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量。甘油三酯大部分是从饮食中获得的，同时肝脏、脂肪等组织还可以进行甘油三酯的合成，在脂肪组织中贮存。（四）甘油三酯增高常见于肥胖、糖尿病、肾病综合症、糖原沉积症、高血压、冠心病等，也随年龄而上升。降低多见于甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能低下、肝功能严重低下。八八思考思考题简述酶法测定甘油三酯的原理。正常人空腹血清TG浓度是多少？说明TG的测定的临床意义。酶法法测定血清中的胆固醇定血清中的胆固醇一一.目的要求目的要求了解血清胆
8、固醇氧化酶法测定的原理了解血清胆固醇测定的临床意义巩固酶标仪测定法的原理和操作二二实验原理原理胆固醇脂酶可将胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸。胆固醇在胆固醇氧化酶催化下，生成胆甾烯酮和H2O2。H2O2在过氧化物酶（POD）催化下与4-氨基安替比林（4-AAP）及ESPAS（3-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺）反应生成紫色醌亚胺染料。形成的醌亚胺染料色泽强度与样品中胆固醇的含量成正比。测定标准样品溶液和待测血清样品反应生成的醌亚胺染料吸光度（A）值，即可求出待测血清样品中总胆固醇的浓量。反应如下：胆固醇酯（胆固醇酯（TC）H2OH2O2 4-AAP ESPAS醌亚胺醌亚胺 染料染料 H2O
9、 胆固醇胆固醇+RCOOH胆固醇胆固醇+O24-胆甾烯酮胆甾烯酮+H2O2胆固醇脂酶胆固醇脂酶胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶 过氧化物酶过氧化物酶三器材及三器材及试剂1器材：器材：（1）酶标仪（2）恒温水浴箱三器材及三器材及试剂2试剂：四四操作步操作步骤取酶标条1个（每个样品2个重复），按下表操作：37保温5min，空白调零，550nm处测定各孔A值。试剂（ul）空白孔标准孔测定孔蒸馏水35.17mmol/L标准品3样本3酶试剂（工作液）300300300五五计算算标准液浓度标准液浓度=5.17mmol/L（mmol/L）六六相关知相关知识与与临床床意意义 胆固醇为固醇类中的重要物质，是环戊烷多氢菲
10、的衍生物。胆固醇酯化的位点胆固醇酯化的位点六六相关知相关知识与与临床意床意义 1胆固醇的生理功能是生物膜的重要成分，对控制生物膜的流动性有重要作用；是合成胆汁酸、类固醇激素及维生素D等生理活性物质的前体。六六相关知相关知识与与临床意床意义 2胆固醇在体内含量及分布 含量：约140克 分布：广泛分布于全身各组织中大约1/4分布在脑、神经组织肝、肾、肠等内脏、皮肤、脂肪组织中也较多肌肉组织含量较低肾上腺、卵巢等合成类固醇激素的腺体含量较高 存在形式：游离胆固醇 30%胆固醇酯 70%六六相关知相关知识与与临床意床意义 3胆固醇的合成部位 组织定位：除成年动物脑组织及成熟红细胞外，几乎全身各组织均可
11、合成，（肝最旺盛，其次为小肠）细胞定位：胞液、内质网 六六相关知相关知识与与临床意床意义 4胆固醇的合成步骤 一般认为乙酸等物质在动物体内是合成胆固醇的原料。限速酶：限速酶：HMGCoA还原酶还原酶u合成前体乙酸u需要NADPH和ATPu高度调控u发生在细胞质u内质网u细胞液六六相关知相关知识与与临床意床意义 5胆固醇合成的调节限速限速酶HMG-CoA还原酶还原酶 酶的活性具有昼夜节律性 (午夜最高，中午最低）可被磷酸化而失活，脱磷酸可恢复活性 受胆固醇的反馈抑制作用 胰岛素甲状腺素能甲状腺素能诱导肝肝HMG-CoAHMG-CoA还原原酶的的合成，合成，又促又促进胆固醇胆固醇转变为胆汁酸可使血
12、中胆固醇下降胆汁酸可使血中胆固醇下降六六相关知相关知识与与临床意床意义 6胆固醇的降解 目前一般认为胆固醇主要经由胆汁排出体外。由于环结构不能代谢，体内胆固醇的清除是将其转变成胆汁酸，在分泌到小肠以后，部分随粪便排出。六六相关知相关知识与与临床意床意义 7胆固醇的转变 类固醇激素（肾上腺皮质激素、孕激素、雄激素、雌激素等）胆固醇 胆汁酸脱氢胆固醇维生素D六六相关知相关知识与与临床意床意义 8血清胆固醇测定的临床意义(1)血清胆固醇浓度可作为酯类代谢的标志，对糖尿病患者的预后有重要意义。糖尿病昏迷患者几乎都伴有血清胆固醇浓度的增加。胆固醇增加还见于动脉粥样硬化、肾病综合征、总胆管阻塞及粘液性水肿
13、。其他如肥大性骨关节炎、老年性白内障、牛皮癣等，血清胆固醇浓度间或也有增加。（2）在恶性贫血、溶血性贫血以及甲状腺功能亢进时，血清胆固醇含量降低，其他如感染、营养不良等情况下，胆固醇总量常见减低。（3）胆固醇酯系由胆固醇与脂肪酸结合而成，此反应主要在肝脏内进行。肝脏有实质性病变时，胆固醇的含量可显著地减少，同时在胆固醇总量内所占的比例亦明显减低，故其测定有助于肝脏疾病诊断。胆固醇酯的含量与比例日渐减低是预后不良的征兆。六六相关知相关知识与与临床意床意义 9参考值 血清胆固醇水平与性别、年龄、饮食、生活习惯、精神因素、工作性质、运动及吸烟等有关。成人参考值为：2.86.0mmol/L（10023
14、0mg/dl）血清正常上限值：5.20mmol/L 危险阈值：5.20-6.20mmol/L 高胆固醇血症：6.20mmol/L 六六相关知相关知识与与临床意床意义 胆固醇增高、降低的常见疾病 胆固醇增高 胆固醇降低 家族性高胆固醇血症 无脂蛋白血症 LDL-R缺陷 低脂蛋白血症 混合性高脂蛋白血症 脂蛋白缺乏症 家族性高HDL血症 家族性LCAT缺乏症 家族性型高脂蛋白血症 内分泌疾病 严重肝脏疾病 甲状腺功能减低 急性肝坏死 糖尿病（昏迷）肝硬化 肝脏疾病 甲状腺功能亢进 阻塞性黄疸 艾迪生病 肝癌 严重营养不良 肾脏疾病 吸收不良症候群 肾病综合征 严重贫血 慢性肾炎肾病期 白血病 应用类固醇类制剂七七思考思考题1简述酶法测定胆固醇的原理。2.正常人空腹血清胆固醇浓度是多少？说明胆固醇的测定的临床意义。