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1、基于基于动态代谢组学分析与合成途径动力学动态代谢组学分析与合成途径动力学模型模型的的代谢代谢途径途径诊断方法的构建与应用诊断方法的构建与应用 2015年微生物代谢工程与发酵工程学术年微生物代谢工程与发酵工程学术研讨研讨会会无锡无锡报告人：刘报告人：刘龙龙江南大学生物工程学院江南大学生物工程学院2015-11-11报告提纲报告提纲一、研究背景二、系统代谢调控Bacillus subtilis合成N-乙酰氨糖(GlcNAc)三、稳态代谢组学定量解析B.subtilis工程菌代谢特性四、基于GlcNAc合成途径动力学模型的代谢瓶颈诊断与解除五、研究结论1.发酵工程与代谢工程发酵工程与代谢工程发酵工程
2、与代谢发酵工程与代谢工程的重要工程的重要意义意义:l发酵工程利用可再生资源生产燃料、工业化合物及功能营养品，发酵工程利用可再生资源生产燃料、工业化合物及功能营养品，实现绿实现绿色色经济与经济与低碳经济，微生物低碳经济，微生物菌种选育和构建是发酵工程的基础和核心；菌种选育和构建是发酵工程的基础和核心；l代谢工程已成为微生物菌种选育和构建的重要手段，是发酵工程领域的代谢工程已成为微生物菌种选育和构建的重要手段，是发酵工程领域的一个重要分支和研究热点。一个重要分支和研究热点。1.1 代谢工程研究的一般思路与方法代谢工程研究的一般思路与方法微生物代谢工程研究的一般思路微生物代谢工程研究的一般思路:1、
3、基于文献、基于文献/数据库分析的目标产物合成途径理性设计；数据库分析的目标产物合成途径理性设计；2、代谢产物、代谢产物(目标产物、副产物目标产物、副产物)合成途径的局部调控；合成途径的局部调控；3、工程菌生产特性及代谢网络的系统优化与全局调控；、工程菌生产特性及代谢网络的系统优化与全局调控；4、动力学、动力学/组学分析组学分析确定代谢确定代谢瓶颈，进行新一轮代谢瓶颈，进行新一轮代谢改造。改造。1.2 代谢途径理性设计的一般思路代谢途径理性设计的一般思路代谢途径理性设计代谢途径理性设计的的一般思路一般思路:1、文献、文献/数据库数据库/化合物库分析寻找合适的目标产物合成途径化合物库分析寻找合适的
4、目标产物合成途径(酶酶)2、在微生物宿主高效表达目标基因、在微生物宿主高效表达目标基因(微生物、动物、植物微生物、动物、植物)3、若文献、若文献/数据库无合适的基因数据库无合适的基因(酶酶)，需首先利用高通量筛选技术筛选获，需首先利用高通量筛选技术筛选获 得目标微生物得目标微生物4、利用比较基因组学和转录组学确定目标产物合成基因、利用比较基因组学和转录组学确定目标产物合成基因(簇簇)5、根据酶反应特点利用计算机软件模拟并合成人工途径酶、根据酶反应特点利用计算机软件模拟并合成人工途径酶1.3 代谢途径优化与调控一般思路与方法代谢途径优化与调控一般思路与方法代谢途径优化与调控一般思路代谢途径优化与
5、调控一般思路:l表达方式优化表达方式优化(游离游离、整合整合)l启动子工程启动子工程l终止子工程终止子工程l转录因子调控转录因子调控l核糖体工程核糖体工程l代谢途径代谢途径(酶酶)定向进化定向进化l空间支架构建空间支架构建l体外重构反应体系体外重构反应体系l底物转运底物转运/产物输出强化产物输出强化表达方式表达方式优化优化启动子工程启动子工程终止子工程终止子工程转录因子调控转录因子调控核糖体工程核糖体工程代谢途径代谢途径(酶酶)进化进化空间支架空间支架构建构建体外重构反应体系体外重构反应体系底物转运底物转运/产物产物输输出途径出途径强化强化代谢代谢网络系统优化与网络系统优化与整体调控常用方法整
6、体调控常用方法:l全局转录机器工程全局转录机器工程l模块途径工程模块途径工程l全基因组规模代谢网络模型构建与调控全基因组规模代谢网络模型构建与调控l代谢通路定位工程代谢通路定位工程1.4 代谢网络系统优化与整体调控一般思路与方法代谢网络系统优化与整体调控一般思路与方法1.5 代谢网络系统分析的一般方法及不足代谢网络系统分析的一般方法及不足代谢网络系统分析方法：代谢网络系统分析方法：l基于稳态组学数据分析和预测基于稳态组学数据分析和预测靶点靶点l基于稳态流量平衡分析的基因基于稳态流量平衡分析的基因组规模代谢网络模型预测限速组规模代谢网络模型预测限速步骤步骤l胞外重构代谢途径分析合成动胞外重构代谢
7、途径分析合成动力学、鉴定限速步骤力学、鉴定限速步骤l目前目前合成合成途径起始阶段途径起始阶段动力学动力学以及反应动力学模型的以及反应动力学模型的研究研究方方法未建立法未建立。l胞胞内内代谢物动力学是细胞代谢状态最直接的体现，代谢物动力学是细胞代谢状态最直接的体现，利用利用稳态代谢网络分析可稳态代谢网络分析可发现代谢瓶颈发现代谢瓶颈/代谢异常，但不能解释代谢瓶颈代谢异常，但不能解释代谢瓶颈/代谢异常产生的原因。代谢异常产生的原因。l在稳态代谢组学分析的基础上，将动态代谢组学和合成途径动力学模拟相结在稳态代谢组学分析的基础上，将动态代谢组学和合成途径动力学模拟相结合能鉴定代谢瓶颈合能鉴定代谢瓶颈/
8、异常及其产生原因，提高异常及其产生原因，提高对对限速步骤的调控能力限速步骤的调控能力。Analyzing transcriptome,proteome and metabolome in steady state for identifying engineering target 2.代谢调控代谢调控B.subtilis 生产生产N-乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)l医药医药领域，治疗领域，治疗关节炎关节炎l营养营养保健，延缓保健，延缓衰老衰老l化妆品化妆品，促进胶原蛋白，促进胶原蛋白生成生成N-乙酰氨基乙酰氨基葡萄糖应用领域葡萄糖应用领域B.subtilis 作为作为生产菌株的
9、生产菌株的优势优势l可用来生产食品安全级产品可用来生产食品安全级产品l遗传背景遗传背景清晰清晰l代谢代谢改造技术成熟改造技术成熟l不易不易受噬菌体污染，适于工业化受噬菌体污染，适于工业化生产生产 2.1 氨氨糖合成糖合成途径设计与构建途径设计与构建glmS和和GNA1基因克隆表达基因克隆表达过量过量表达氨糖合成酶表达氨糖合成酶(GlmS)和和6-磷酸氨糖乙酰化酶磷酸氨糖乙酰化酶(GNA1)实现实现了了氨基葡萄糖氨基葡萄糖GlcN和和N-乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖GlcNAc的初步积累的初步积累(240 mg/L)。枯草芽孢杆菌中GlcNAc合成与代谢途径 pP43NMK7680 bpHind
10、 IIIKpn IColE1 origna1P43blarepBKmbleCaenorhabditiselegansTrypanosomabruceiSaccharomycescerevisiaeS288cCandida albicansOryza sativanagP基因敲除流程图 l敲除敲除nagP基因阻断了基因阻断了GlcNAc由胞外向胞由胞外向胞内转运内转运l敲敲除除nagA、nagB和和gamA三个基因进一三个基因进一步阻断胞内步阻断胞内GlcNAc降解降解途径途径l促进促进GlcNAc胞胞外积累，产量提高外积累，产量提高了了17倍倍 2.1 氨糖合成途径设计与构建氨糖合成途径设计与
11、构建GlcNAc转运及分解代谢阻断转运及分解代谢阻断验证nagA、nagB和gamA基因敲除成功 2.2 氨糖合成途径优化与调控氨糖合成途径优化与调控GlcNAc合成途径合成途径(酶酶)定向进化定向进化氨基葡萄糖合成酶GlmS结构模型氨基葡萄糖N-乙酰化酶GNA1结构模型突变体对细胞生长和GlcNAc合成的影响 2.2 氨糖合成途径优化与调控氨糖合成途径优化与调控GlcNAc合成关键酶合成关键酶表达调控表达调控GlmS和GNA1的启动子系统优化(游离/整合表达、表达强度适配)构建基于DNA与锌指蛋白质之间的特异性相互作用的支架系统对GlmS 和Gna1的表达进行区域化调控GlcNAc在在3-L
12、发酵罐上发酵罐上GlcNAc产量达产量达20.6 g/L 2.2 氨糖合成途径优化与调控氨糖合成途径优化与调控葡萄糖转运、代谢途径调控葡萄糖转运、代谢途径调控l分别敲除分别敲除glcP基因和基因和EIIA(yyzE、ypqE)基因阻断基因阻断NPTS和和PTS葡萄糖转运系统葡萄糖转运系统l利用利用PTS转运系统更有利于转运系统更有利于GlcNAc合成，但丙酮酸积累，细胞合成，但丙酮酸积累，细胞生长慢生长慢l敲除敲除丙酮酸激酶丙酮酸激酶(pyk)和和PEP羧化酶羧化酶(pckA)降低丙酮酸合成，降低丙酮酸合成，GlcNAc产量提高产量提高60%2.2 氨糖合成途径优化与调控氨糖合成途径优化与调控
13、中心代谢途径调控中心代谢途径调控l分别敲除分别敲除ldh基因和基因和eutD基因阻断基因阻断乳酸乳酸和乙酸的合成和乙酸的合成l敲敲除除alsS、alsD和和bdhA阻断乙偶姻的合成阻断乙偶姻的合成l为保持氧化还原平衡，整合表达为保持氧化还原平衡，整合表达NADH氧化酶，在氧化酶，在3-L发酵罐上发酵罐上GlcNAc产量达产量达37g/Ll表达表达anti-pfk sRNA，控制，控制糖酵解模块活性在中等水糖酵解模块活性在中等水平平(60%)l表达表达anti-glmM sRNA，限，限制肽聚糖合成糖酵解模块制肽聚糖合成糖酵解模块活性在活性在中等中等水平水平(60%)l共表达共表达anti-pf
14、k sRNA以及以及anti-glmM sRNA及及Hfq蛋白，蛋白，限制限制肽聚糖、糖酵解模块肽聚糖、糖酵解模块活性在低水平活性在低水平(30%)sRNA能够有效能够有效限制限制GlcNAc合成合成竞争模块（糖酵解及肽聚糖模块竞争模块（糖酵解及肽聚糖模块）2.3 氨糖代谢网络系统优化与调控氨糖代谢网络系统优化与调控-构建构建sRNA调控工具调控工具通过将不同活性模块进行优化组装通过将不同活性模块进行优化组装，GlcNAc摇瓶产量摇瓶产量达到达到8.30 g/L，在，在3-L发发酵罐上产量达到酵罐上产量达到42 g/L。2.3 氨糖代谢网络系统优化与调控氨糖代谢网络系统优化与调控-基于基于sR
15、NA的模块调控的模块调控3.基于代谢组学与合成途径动力学模型的诊断方法基于代谢组学与合成途径动力学模型的诊断方法的的构建构建l稳态代谢组学系统分析高产菌株与稳态代谢组学系统分析高产菌株与出发菌株的胞内代谢差异，鉴定代出发菌株的胞内代谢差异，鉴定代谢瓶颈和代谢异常谢瓶颈和代谢异常l动态代谢组学及合成动态代谢组学及合成途径途径动力学模动力学模拟分析产物合成瓶颈产生原因拟分析产物合成瓶颈产生原因l13C同位素分析进一步验证合成瓶同位素分析进一步验证合成瓶颈，并进一步通过代谢调控解除代颈，并进一步通过代谢调控解除代谢瓶颈谢瓶颈 3.1 稳态稳态代谢代谢组学组学解析细胞代谢解析细胞代谢特性特性工程工程菌
16、代谢物水平发生何种变化菌代谢物水平发生何种变化?F6P和和Gln过量过量消耗是否影响菌体生长消耗是否影响菌体生长?F6P和和GlnGlcNAc 合成合成中心碳代谢中心碳代谢及氮代谢及氮代谢GlcNAc合成途径及野生菌株与合成途径及野生菌株与GlcNAc过过量合成菌株量合成菌株BSGN细胞生长比较细胞生长比较3.1 中心中心代谢产物谱定量解析代谢产物谱定量解析代谢物名称代谢物名称变化倍数变化倍数浓度升高代谢物浓度升高代谢物乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸磷酸569.80823.373 单磷酸鸟苷单磷酸鸟苷5.6481.351烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸1.643460.112赤
17、藓糖赤藓糖-4-磷酸磷酸1.5030.248浓度浓度降低代谢物降低代谢物氨基葡萄糖氨基葡萄糖-6-磷酸磷酸0.1080.023脯氨酸脯氨酸0.1890.039还原型烟酰胺腺嘌呤二核还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸苷酸磷酸0.2010.005柠檬酸、异柠檬酸柠檬酸、异柠檬酸0.2190.021缬氨酸缬氨酸0.2380.011三磷酸鸟苷三磷酸鸟苷0.2410.036谷氨酰胺谷氨酰胺0.2620.006精氨酸精氨酸0.2880.010 浓度显著变化代谢物浓度显著变化代谢物3.1 中心中心代谢产物谱定量解析代谢产物谱定量解析工程菌工程菌工程菌工程菌BSGNBSGN与野生菌与野生菌与野生菌与野生菌B.su
18、btilis B.subtilis 168168胞内代谢物变化胞内代谢物变化胞内代谢物变化胞内代谢物变化l糖酵解途径、氨基酸合成以及糖酵解途径、氨基酸合成以及TCA循环代谢物水平显著循环代谢物水平显著降低，降低，F6P和和Gln降低降低2倍以上倍以上；l胞内胞内GlcNAcP 升高升高570倍。倍。何种过量消耗前体何种过量消耗前体(F6P或或Gln)对对工程工程菌菌BSGN代谢影响更为关键代谢影响更为关键?GlcNAc 合成及糖酵解途径合成及糖酵解途径TCA循环循环氨基酸合成氨基酸合成3.1 中心中心代谢产物谱定量解析代谢产物谱定量解析减少中心碳代谢减少中心碳代谢减少中心碳代谢减少中心碳代谢F
19、6PF6P对代谢变化的影响对代谢变化的影响对代谢变化的影响对代谢变化的影响 在在F6P代谢节点处减少底物对中心代谢途径供给，对胞内糖酵解途径、氨基酸合成以及代谢节点处减少底物对中心代谢途径供给，对胞内糖酵解途径、氨基酸合成以及TCA循环的代谢物浓度无明显影响循环的代谢物浓度无明显影响。F6P供给非引起细胞生长和代谢变化的关键因素。供给非引起细胞生长和代谢变化的关键因素。F6PGlcNAc合成合成在在基因组基因组Pfk引入突变引入突变(R252A)，降低其活性，降低其活性中心代谢中心代谢Kinetics of PFKKinetics of PFK R252A mutant如果如果F6P为关键因素
20、，进一步减少为关键因素，进一步减少F6P中心碳代谢水平应进一步降低。中心碳代谢水平应进一步降低。GlcNAc 合成及糖酵解途径合成及糖酵解途径TCA循环循环氨基酸合成氨基酸合成3.1 中心中心代谢产物谱定量解析代谢产物谱定量解析增加增加增加增加GlnGln供给对代谢变化的影响供给对代谢变化的影响供给对代谢变化的影响供给对代谢变化的影响代谢水平几乎全部得到代谢水平几乎全部得到恢复，但细胞生长仍然较慢恢复，但细胞生长仍然较慢Pfk突变突变和和GS过量表达对工程过量表达对工程菌能荷水平是否菌能荷水平是否有影响有影响?过量表达过量表达Gln合成酶，增加合成酶，增加Gln供给供给GlnGluAc-CoA
21、CoAGlucoseGlc-6-PFru-6-PGlcN-6-PGlcNAc-6-P GlcNAcGlycolysisGSGlcNAc 合成及糖酵解途径合成及糖酵解途径TCA循环循环氨基酸合成氨基酸合成3.1 中心中心代谢产物谱定量解析代谢产物谱定量解析Pfk 突变对细胞能荷无明显影响；突变对细胞能荷无明显影响；GlcNAc过量合成对中心过量合成对中心碳、氮代谢的碳、氮代谢的影响不是限制细胞生长的关键因素。影响不是限制细胞生长的关键因素。细胞能荷、比生长速率、比产物合成速率比较细胞能荷、比生长速率、比产物合成速率比较代谢物名称代谢物名称浓度（浓度（mM）动力学参数动力学参数果糖果糖-6-磷酸磷
22、酸4.1670.474Km 0.6 mM氨基葡萄糖氨基葡萄糖-6-磷酸磷酸0.0170.003Km 0.1 mM;乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸磷酸33.713.013-谷氨酰胺谷氨酰胺7.4200.484Km 0.2 mM谷氨酸谷氨酸101.6162.593-3.1 中心中心代谢产物谱定量解析代谢产物谱定量解析l胞内胞内GlcNAc6P升高升高570倍倍GlucoseGlc-6-PFru-6-PPTS uptake pathway过量磷酸糖对细胞有毒害作用过量磷酸糖对细胞有毒害作用:l抑制葡萄糖抑制葡萄糖吸收吸收l避免过量避免过量磷酸糖磷酸糖积累可解除积累可解除抑制作用。抑制作用。G
23、lucoseGlcNAc合成过程中，合成过程中，GlcNAc途径代谢物如何动态变化途径代谢物如何动态变化?GlcNAc6P为工程菌产物合成及细胞生长的潜在瓶颈为工程菌产物合成及细胞生长的潜在瓶颈?4.1 GlcNAc合成途径动力学分析合成途径动力学分析l将动力学模型与系统生物学数据相结合是分析代谢调控机理的重要手段将动力学模型与系统生物学数据相结合是分析代谢调控机理的重要手段l建立建立GlcNAc合成途径动力学模型结合动态代谢组学鉴定合成途径中的瓶颈合成途径动力学模型结合动态代谢组学鉴定合成途径中的瓶颈l验证并且去除合成途径中瓶颈进一步促进验证并且去除合成途径中瓶颈进一步促进GlcNAc合成合
24、成4.2 GlcNAc合成途径动力学分析合成途径动力学分析动力学模拟动力学模拟GlcNAc合成途径化学计量数的微分方程组合成途径化学计量数的微分方程组4.2 GlcNAc合成途径动力学分析合成途径动力学分析动力学模拟动力学模拟无限速步骤无限速步骤反馈抑制反馈抑制某一反应速率低于其他反应速率某一反应速率低于其他反应速率反应途径中反应途径中存在无效存在无效循环循环产物输出能力不足产物输出能力不足反应途径末端反应途径末端存在无效存在无效循环循环4.2 GlcNAc合成途径动力学合成途径动力学分析分析动力学模拟动力学模拟不同限速步骤及其代谢途不同限速步骤及其代谢途径动力学特征：径动力学特征：l反馈抑制
25、：代谢物反馈抑制：代谢物浓度浓度低于低于Km值，且无法达到值，且无法达到稳态；稳态；l代谢途径中代谢途径中存在限速反存在限速反应及应及无效循环：上游代无效循环：上游代谢物积累；谢物积累；l代谢途径末端存在无效代谢途径末端存在无效循环循环：胞胞内、胞外产物内、胞外产物总浓度降低；总浓度降低；l产物输出效率不足：胞产物输出效率不足：胞内产物积累。内产物积累。4.3 GlcNAc合成途径动力学合成途径动力学分析分析动态代谢组学动态代谢组学动态动态代谢组代谢组学测定：学测定：1)通过通过底物添加，开启产物底物添加，开启产物合成途径；合成途径；2)GlcNAc比合成速率保持恒比合成速率保持恒定，达到定，
26、达到7.7 mg/g DCW/h。该该GlcNAc比合成速率与重组比合成速率与重组菌菌BSGN在使用基本培养基进在使用基本培养基进行摇瓶发酵时的行摇瓶发酵时的GlcNAc比合比合成速率成速率相近；相近；3)基于代谢基于代谢组学组学采用采用快速取快速取样及高效淬灭的方法对样及高效淬灭的方法对GlcNAc合成途径开启后合成途径开启后2 min之内之内的动力学进行的动力学进行分析。分析。4.4 GlcNAc合成途径动力学合成途径动力学分析分析限速步骤预测限速步骤预测l氨糖途径动力学变化符合氨糖途径动力学变化符合GlcNAc-6-P与与GlcNAc无效循环模型模拟特征无效循环模型模拟特征lF6P、Ac
27、CoA和和Gln浓度大于途径酶浓度大于途径酶Km值，底物供给值，底物供给充足非充足非限制性因素限制性因素l未知激酶催化胞内未知激酶催化胞内GlcNAc的磷酸化生成的磷酸化生成6-P-GlcNAc4.5 GlcNAc合成途径动力学合成途径动力学分析分析预测结果验证预测结果验证若若存在存在将胞内将胞内GlcNAc磷酸化为磷酸化为GlcNAc-6-P的代谢流时，添加的代谢流时，添加U-13C葡萄糖开葡萄糖开启启GlcNAc合成途径，合成途径，GlcNAc-6-P来源于胞内来源于胞内GlcNAc而不是而不是U-13C葡萄糖葡萄糖。当添加当添加U-13C葡萄糖开启葡萄糖开启GlcNAc合成途径后，未被合
28、成途径后，未被13C标记的标记的GlcNAc-6-P质量质量同模子同模子M+0的分数始终保持在的分数始终保持在100%，而被，而被13C标记的标记的GlcNAc-6-P质量同模子质量同模子M+6和和M+8的分数没有的分数没有增加增加。4.6 GlcNAc合成途径动力学分析合成途径动力学分析限速步骤去除限速步骤去除lB.subtilis已已注释基因中尚无注释基因中尚无GlcNAc激酶的激酶的注释注释。将将E.coli中中GlcNAc激酶的氨基酸序列与激酶的氨基酸序列与B.subtilis中中106个个激酶激酶的氨基酸序列进行比的氨基酸序列进行比对对，发现葡萄糖，发现葡萄糖激酶激酶GlcK与与E.
29、coli中中GlcNAc激酶的激酶的氨基酸序列相似度氨基酸序列相似度最高最高(26%)。l敲敲除葡萄糖激酶编码基因除葡萄糖激酶编码基因glcK，在基本培养基中细胞，在基本培养基中细胞比生长速率比生长速率(0.15 h-1)及及氨糖生产氨糖生产强度强度(9.33 mg/L/h)为为敲除前的敲除前的2.1和和2.3倍。倍。5、研究结论、研究结论l建立建立GlcNAc合成途径动力学模型，模拟不同限速步骤存在时合成途径动力学模型，模拟不同限速步骤存在时GlcNAc合成合成途径由关闭到开启状态时动力学，并且鉴定了途径由关闭到开启状态时动力学，并且鉴定了不同限速步骤存在时的动不同限速步骤存在时的动力学特征
30、力学特征。l通过通过控制底物葡萄糖添加，实现控制底物葡萄糖添加，实现GlcNAc合成途径由关闭到开启。采用快合成途径由关闭到开启。采用快速取样、高效淬灭以及靶向代谢组学，实现对速取样、高效淬灭以及靶向代谢组学，实现对GlcNAc合成途径开启后合成途径开启后2 min之内的之内的动动态代谢组学态代谢组学测定。测定。l将将实验测定实验测定GlcNAc合成途径动力学合成途径动力学与动力学与动力学模拟结果比较模拟结果比较，发现发现GlcNAc-6-P与胞内与胞内GlcNAc之间存在无效之间存在无效循环循环为为GlcNAc合成途径潜在限速步骤合成途径潜在限速步骤。l进一步进一步使用使用U-13C葡萄糖动
31、态标记葡萄糖动态标记实验实验证实了无效循环证实了无效循环存在存在。通过通过敲除敲除重组菌重组菌BSGN中葡萄糖激酶编码基因中葡萄糖激酶编码基因glcK，胞内，胞内GlcNAc转化为转化为GlcNAc-6-P的的无效无效循环循环得以阻断，得以阻断，细胞比生长速率和细胞比生长速率和GlcNAc生产强度生产强度分别分别提高了提高了2.1倍倍和和2.3倍倍。相关相关发表论文发表论文lLiu et al.,Biotechnology and Bioengineering.2015.In revisionlLiu et al.,Critical Reviews in Biotechnology.2015.
32、Accepted/In press.lYin et al.,Biotechnology Advances.2015.33:830-841.lLiu et al.,Applied Environmental Microbiology.2015.81:2256-2264lHan et al.,Biotechnology Advances.2014.32:415-428.lLiu et al.,Metabolic Engineering.2014,24:61-69.lLiu et al.,Metabolic Engineering.2014,23:42-52.lLiu et al.,Metabolic Engineering.2013,19:107-115.lZhang et al.,Metabolic Engineering.2012,14:521-527.谢谢！请多提宝贵意见！谢谢！请多提宝贵意见！