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1、枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 Bacillus Subtilis陈家馨 王玲玲 沈嘉妮Contents介绍枯草芽孢杆菌1为什么选择枯草芽孢杆菌2 建立beadzillus开发Sporo beads3Sporo beads是什么4Sporo beads的应用5目目录录2 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌，芽孢杆菌属的一种。因为易在枯草浸液中繁殖，所以人们取名枯草芽孢杆菌。革兰氏阳性菌，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。3枯草芽孢杆菌能够分化成具有不同形态和功能的细胞。最特征的形式是在营养不足的情况下产生的内生孢子。在
2、我们的项目中，我们利用了内生孢子的生产。因为它们是极其稳定的，孢子是用于功能性融合蛋白的。枯草芽孢杆菌的生命周期和不同的细胞阶段。营养周期与大肠杆菌非常相似。然而，在诸如饥饿等压力源的情况下，细胞进入孢子形成，首先进行极细胞分裂，然后形成内生孢子。如果环境条件再次合适，则孢子会发芽并重新进入营养循环。4枯草芽孢杆菌的自然栖息地是土壤，被迫适应许多环境变化。因此，枯草芽孢杆菌的特征在于快速和狡猾的反射和复杂的生活方式。由于其天然的能力，它可以占据外源DNA并将其整合到其基因组中。灵活应对环境，转向营养或避免有毒物质，它的活动是借助其鞭毛。如果饥饿，一些细胞甚至成为食人兄弟姐妹。如果条件对于生存来
3、说太糟糕了，枯草芽孢杆菌可以形成内生孢子。这些是非常休眠和高度稳定的阶段，耐干燥，紫外线，热和压力。一旦这些孢子遇到更好的条件，他们才能再次发芽。芽孢杆菌的分化在枯草芽孢杆菌群落中区分不同细胞类型的示意图501易于培养和进行遗传操作02标准化质粒原件和相应的基因改造方法03安全性模式生物需要满足的条件6 迄今为止大部分的合成生物学操作都是基于大肠杆菌（Escherichia coli）的，大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌具有革兰氏阴性菌不具有的一些优势，比如：革兰氏阳性菌有天然的外源基因摄入和整合入基因组的机制，这种机制为遗传操作提供了方便；革兰氏阳性菌的分泌机制比较完善，蛋白质表达后
4、可以很好地分泌到细胞外，而这正是革兰氏阴性菌在异源蛋白表达时面临的最大问题。枯草芽孢杆菌革兰氏阳性菌7枯草芽孢杆菌可以复制大肠杆菌的质粒，但是有一种更优雅的方式引入外源DNA片段。当侧面与枯草芽孢杆菌基因组同源时，将通过在该基因座处的同源重组以高效率整合，随后用染色体复制。这导致稳定的单拷贝基因组改变，从而避免使用复制质粒发生的拷贝数伪影。这种不同的基因操作的方式需要使用整合载体，如通过我们提供B4-22。因此，枯草芽孢杆菌是合成生物学的理想遗传平台。枯草芽孢杆菌的转化8为了使枯草芽孢杆菌满足合成生物学模式生物的要求，核心就是构建模块化的标准。这倒也不是很困难，只需要将大肠杆菌的基因零件标准在
5、枯草芽孢杆菌的质粒上重构一下就可以了，枯草芽孢杆菌质粒与大肠杆菌不同之处是存在基因组整合位点，将这个位点引入还有零件标准的质粒中，就构建成了枯草芽孢杆菌标准化质粒了。之后，慕尼黑大学构建了一系列适用于芽孢杆菌的启动子，包括常规表达的启动子和诱导表达的启动子。另外，他们还测试了常用的报告基因在这个质粒系统中的表达情况，这些报告基因都针对枯草芽孢杆菌进行了密码子优化（Coden Optimization）。这些报告基因包括绿色荧光蛋白、lacZ、荧光素酶。最后，他们测试了常用的蛋白纯化标签在枯草芽孢杆菌中的作用。这些工作并没有什么出彩之处，因为他们的正常工作早已经被验证过。有了标准化质粒、启动子、
6、终止子、报告基因和纯化标签，一个合成生物学模式生物就基本上建立了。构建芽孢杆菌标准化质粒9 引入枯草芽孢杆菌作为基于BioBrick的合成生物学的新底盘是此项目的主要目标。B4-22核心部分包含以下芽孢杆菌的特定部分Vertors（载体）promoters（启动子）reporters（通讯员）affinity tags（亲和标签）我们所有的标签都是由GeneArt合成的。我们的亲和标签还未验证。创建B 4-22核心部分10它们都通过在特定位点的双重同源重组插入到基因组中。因此，枯草芽孢杆菌中的靶基因被破坏，可以通过特定的检测来选择。载体的整合机制1101发光测量02-半乳糖苷酶测定启动子的评估
7、方式12一，安德森系列启动子评估它们已经在大肠杆菌中被广泛测量，在枯草芽孢杆菌中测定了11只安德森启动子，并显示相对较弱的活性。二，组成型芽孢杆菌启动子构建了三种新的枯草芽孢杆菌启动子（P liaG，P veg，P lepA）PliaG该启动子显示比Anderson启动子高得多的活性，但与其他评估的芽孢杆菌启动子相比仍然相对较弱。Pveg这个推动者是我们评估中最强的。PlepA该启动子的活性在最强的芽孢杆菌启动子P veg的活性和弱P liaG之间。P XYL-xylR是从木糖诱导启动子枯草芽孢杆菌。对于这种启动子，我们尚未成功克隆到报告载体中以评价活性。三组启动子的评估13三，诱导性芽胞杆菌
8、启动子启动子的最后一组包括来自两个诱导型启动子的枯草芽孢杆菌，P LIAI和xylR-P XYL。一种新的抗生素诱导的启动子P lial其响应于干扰细胞壁的完整性和生物合成的抗生素。在刺激的情况下，双组分系统LiaRS被激活。活化的响应调节剂LiaR与启动子的操纵子结合并诱导ia基因座的转录。当启动子启动时，表达了两种蛋白质LiaI和LiaH。该启动子的主要优点是在不存在诱导物及其高动态范围的情况下具有非常低的基础活性。用不同浓度的杆菌肽测量诱导，证明在大范围的启动子活性中具有浓度依赖性反应。14萤火虫萤光素酶是迄今为止最常用的生物发光通讯员。天然萤火虫荧光素酶作为遗传报告基因的普及是由于酶测
9、定的灵敏度和方便性以及蛋白质合成与酶活性的紧密耦合。由luc基因编码的萤火虫荧光素酶是不需要任何翻译后修饰的单体;它可以作为成熟酶直接在其mRNA翻译中获得。从核糖体释放后立即获得催化能力。此外，荧光素酶在细胞中的半衰期非常短（约3小时）。综合起来，这些性质使荧光素酶成为一个非常敏感的通讯员，远远超过其他常用的通讯员。芽孢杆菌通讯员的选择15芽孢是细菌在逆境中形成的一种致密结构，可以抵抗高低温、缺氧、缺水等一系列不良环境，又可以在良好的环境中重新萌发为完整的菌体。由于芽孢超强的稳定性，有很多潜在的应用可以被开发，比如用来作为蛋白质或其他物质的呈递装置应用在过滤柱中，应用在很多需要进行“过滤”的
10、领域，过滤其实是个挺复杂的事情，并不只是我们日常生活中过滤杂质这么简单。举个例子，海水淡化其实主要就是过滤海水中的阳离子，非常困难的。另外，由于枯草芽孢杆菌本来的生活环境是在土壤中，它必须时刻准备应对环境的变化，于是枯草芽孢杆菌进化出了一种分化机制，可以根据外界环境分化为不同的性状，这就为潜在的多种应用提供了基础。枯草芽孢杆菌会形成芽孢16 我们选择使用枯草芽孢杆菌来设计新的视野，并为这种模型生物提供工具，用于大肠杆菌的iGEM世界。因此，我们在BioBrick标准中创建了由定义的启动子以及报告基因，表达和空载体组成的芽孢杆菌 B io B rick B ox（B 422）。枯草芽孢杆菌天然产
11、生耐应力的内生孢子，其可以根据合适的环境条件发芽。为了突出使用这种独特的功能，我们开发Sporo beads。这些是表面融合蛋白的孢子。我们将GFP（绿色荧光蛋白）融合到最外层。扩大这个想法，我们设计了一个孢粉矢量可以轻松地创建任何孢粉珠。为了保证孢粉珠的安全，我们通过敲除基因参与防止发芽，并制定了自杀开关在发芽的情况下接通。随着项目Bead zillus，我们的团队展示了枯草芽孢杆菌的强大性质。bead zillus：为基本生物砖枯草芽孢杆菌和孢子的蛋白质展示的平台17实验中过滤器的问题过滤器问题过滤器广泛应用于日常生活和实验室。过滤器，例如用于从饮用水和管道系统中去除钙和其他污染物的Bri
12、ta过滤器是丰富的。在实验室中，过滤器（通常称为柱）用于DNA/蛋白质纯化和蛋白质表征。这种过滤器通常由填充有某种类型的矩阵的盒组成。为了使表面最小化，微珠通常用于所有类型的过滤器。这些珠具有特定的尺寸，例如可用于在其表面上显示蛋白质。蛋白质与珠子的偶联是基于亲和力结合。例如可用于结合含有His标签的蛋白质的Ni-NTA树脂（或珠粒）。如果蛋白质以这种方式结合到珠粒上，则其特征然后确定这种负载蛋白质的珠粒的功能特性。这样的珠通常是相当昂贵的，蛋白质与珠子的偶联是费力的，因为蛋白质必须被表达，结合到珠子上然后洗涤。为了解决这个问题，我们已经开发出在我们的项目中的合成生物学的解决方案bead zi
13、llus，其中生物珠显示所选择的蛋白质。我们称这些生物珠孢粉珠。18孢粉珠是以可以用作个体蛋白质显示的平台的方式修饰的枯草芽孢杆菌孢子。该模块的目的是创建在其表面上显示融合蛋白的这些孢子。有几种不同的蛋白质形成枯草芽孢杆菌孢子的孢子层。最外层，即所谓的孢子，由两种蛋白质CotZ和CgeA组成。这就是为什么我们用它们来创建我们要表达功能融合蛋白孢粉珠。孢粉珠是什么19基因敲除我们选择了重要的发芽基因并将其敲除。随后，我们将单个突变体组合成四倍体突变体，并成功地防止了萌发。自杀开关在发芽基因敲除失败的情况下，我们发明了自杀开关。如果孢子仍然发芽，毒素的产生将导致立即的细胞死亡。保证孢粉珠的安全20
14、我们关于如何防止发芽发生的想法是敲除编码发芽过程中涉及的功能的基因。有大量的基因在萌发中发挥作用，但我们的目标是选择一些非常重要的基因敲除。基于他人的研究，我们选择的基因是cwlJ，sleB，cwlB，gerD和 cwlD。显示：cwlJ 和sleB：一起敲除时，发芽频率降低5个数量级。两种基因都代表了在发芽过程中有活性的溶酶。gerD 和 cwlB：一起敲除时，发芽频率降低5个数量级。该 GERD产品起着营养发芽未知的作用;cwlB的产物在细胞壁周转和细胞裂解中起作用。注：在多次尝试后淘汰 cwlB，并产生以非常缓慢的速度生长的细胞无法生长或细胞，我们决定淘汰 cwlB不妥当生产的孢粉珠，因
15、为这将延迟在所有实验发芽停止模块。cwlD：当被淘汰时，发芽率为0.003至0.05。该基因编码由发芽特异性皮质裂解酶切割的识别组分。通过敲除所有这五个基因，我们的目标是产生 枯草芽孢杆菌 菌株，其产生完全不能发芽的孢子。在孢子破坏过程中，发芽停止。没有裂解酶分解外套，孢子应该不能超过营养阶段。基因敲除21作为一个备份计划，以使我们的孢粉珠更安全，我们开发了自杀开关。在孢子发芽的情况下，由于降解或它们的外涂层，例如，通过高压的破坏，自杀开关将被接通。我们利用替代和异源因子和目标启动子。两者都是不存在于枯草芽孢杆菌，并因此不被任何其他因数识别枯草芽孢杆菌。替代因子ecf41 比里aa1-204，
16、其从派生地衣芽孢杆菌组成的截短的版本“ON”是合成链接到二分之一的 调控的启动子强烈响应或P SSPK弱响应。G 是在forespore激活最后因子。因此，Ecf41 Bli aa1-204生产相当晚，只在前景中。Ecf41 Bli aa1-204然后激活其独特的目标启动子P ydfG。该启动子与MazF融合。因此，P ydfG的激活导致MazF（一种来自大肠杆菌降解mRNA 的细菌毒素）的表达。所产生的时间过程如下：Sporo 珠的孢子通过P spoIVB或P sspK的激活导致在分化周期结束时在前孢子中产生Ecf41 Bli aa1-204。随后，由于P ydfG的激活，这将导致MazF的
17、表达。对于我们已经成熟的Sporo珠，这不会有毒，因为它们代表不需要翻译的休眠状态。但是，在一个情况下孢粉珠逸出的萌发基于上述基因敲除STOP自杀开关22孢粉珠是第一代的枯草芽孢杆菌芽孢的最外层，孢子外壳上显示我们选择的蛋白质。在未来Sporo珠可以作为蛋白质显示的平台，因此可用于众多通用应用。我们的目标是显示枯草芽孢杆菌具有这样的能力。作为原理证明，我们成功地将GFP融合到孢子外壳中，并用显微镜获得荧光。孢粉珠显示蛋白23评估孢子外壳蛋白的三个启动子（P cgeA，P cotV，P cotYZ）的结果。对于每个启动子，评估三次独立的克隆。为了将启动子活性与生长期相关联，在整个实验中测量光密度
18、（OD 600）。cotZ，P cotYZ和P cotV的天然促进剂如预期的那样在稳定期显示出明显的信号。P cotYZ比P cotV早两个小时被激活，两个启动子活性约12小时。相反，P cgeA没有显示任何活动。评估孢子外壳蛋白的三个启动子24我们使用ImageJ测量每个孢子750像素的面积的荧光强度。野生型孢子几乎没有任何荧光，而这两个孢粉珠与整合的构建PSB 烧烤 1C-P cotYZ-cotZ-2aa-GFP终止子给周围的孢子的边缘明显的荧光信号。此外，它证明菌株B70具有最高的荧光强度。总之，我们成功地开发官能孢粉珠，其能够改性的表面上显示所选择的任何蛋白质的枯草芽孢杆菌内生孢子。我
19、们从我们的芽孢杆菌 B io B rick B ox中选择了空载体pSB BS 1C 作为cotZ构建体。所有产生的孢粉珠通过荧光显微镜研究。强度条形图显示荧光强度，而3D图则说明了穿过孢子表面的荧光强度的分布。这与我们的融合蛋白在地壳中的定位有关。对于图像分析，我们使用ImageJ测量每个孢子750像素的面积的荧光强度。孢子的荧光强度2526在我们的Sporo矢量的帮助下，我们融合了Bielefeld团队的两个Laccases和cgeA。我们选择了Ecol（大肠杆菌）和Bhal（嗜碱芽孢杆菌）（Bacillus halodurans），因为它们不含任何fobidden限制性位点（NgoMIV
20、或AgeI for Freiburg标准RFC 25）。然而，与比勒菲尔德测试的其他漆酶相比，纯化蛋白质的活性相当低。获得的菌株生长缓慢，但我们能够用底物测试孢子的活性。将该活性与野生型孢子进行比较。结果清楚地显示了两种Laccase-活动孢粉珠。与Bielefeld的结果一致，Bhal的活性高于Ecol。对于我们来说，这证明酶显示在表面上，它仍然工作，它可以进入底物！此外，可以清楚地测量活性，尽管这些不是最佳漆酶。净化方法由于孢子在的Difco（培养基）中生长24小时后，留下了一些营养细胞，我们希望净化孢粉珠。我们尝试了这种方法的三种不同的方法：用法国压力机，超声处理和溶菌酶处理。通过显微结
21、果，我们得出结论，溶菌酶处理是唯一成功的方法。此外，这种治疗并没有损害外壳融合蛋白，因为绿色荧光仍然可以检测。孢粉珠的纯化方法27接下来，我们在溶菌酶处理后测试了Sporobeads的荧光。这一分析显示溶菌酶对gfp融合蛋白没有损害，因为荧光没有改变。28过滤 利用蛋白质筛选我们的孢粉珠可用于通过在其表面上表达特异性结合这些靶标的蛋白质来从重金属离子，毒素和塑料中净化水分。这种结合蛋白质的一个实例可以是CPX-孢粉珠粒。是由2007年MIT iGEM团队开发的一种肽，其极度疏水，因此能够结合水中的聚苯乙烯微粒。过度使用一次性塑料和缺乏通用的回收计划已导致世界海洋的污染。在海洋中，大块塑料垃圾被
22、海流磨碎，并被紫外线辐射降解成微小的碎片，被称为“塑料浮游生物”，被鱼，过滤器饲料和其他海洋生物所消耗。这种塑料吸收会导致中毒，不育和死亡。在巨大的过滤系统，CPX-孢粉珠，其不能发芽，可以被放置就位以过滤微观塑料颗粒出来的水。这种特定的过滤将优于毯式过滤系统，其也去除了对海洋生态系统重要的浮游植物。29表达几乎任何感兴趣的蛋白质的能力显示了实验室工作的巨大潜力。我们的孢粉珠可以例如表达TAL效应子用于结合序列特异性DNA延伸。这可以允许对粮食作物进行简单的转基因生物检测。除了表达能够结合化合物或感兴趣的离子的蛋白质，我们的孢粉珠也可以显示具有酶活性的蛋白质。在2011年华盛顿大学队iGEM大
23、赛开发的酶，Kumamolisin，其裂解肽。该酶的底物是引起患有腹腔疾病的个体的反应的特定氨基酸序列。这种切割酶可用于消除含麸质食品的刺激物。孢粉矢量孢粉矢量还有我们的许多可能的应用孢粉珠，因为它可以显示各种不同的蛋白质其表面上。为了轻松创建它们，我们设计了一个孢粉向量，只需在其中插入编码您选择的融合蛋白的基因即可。其他应用301.即使在恶劣的环境条件下也非常稳定2.容易和便宜地生产大量3.食物补充剂中人体营养的一部分，一般被认为是安全的。此外，我们的孢粉珠无法增殖，因此很可能不被法律视为转基因生物4.我们的孢粉珠提供各种各样的实验室内的应用程序，并在世界各地。孢粉珠可用于过滤和筛选的蛋白质。潜在优势利用31THANKSL O R E M I P S U M 32