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1、分子流行病学概述及我国分子分子流行病学概述及我国分子流行病学研究现状流行病学研究现状提纲：提纲：一、分子流行病概述一、分子流行病概述(一一)定义定义(二二)分子流行病学研究内容和范围分子流行病学研究内容和范围(三三)分子流行病学常用的主要研究方法分子流行病学常用的主要研究方法二、我国分子流行病学研究现状二、我国分子流行病学研究现状(一一)病原体分型和检测研究病原体分型和检测研究(二二)人群中疾病流行规律、传播机理研究人群中疾病流行规律、传播机理研究(三三)在慢性病研究中的应用在慢性病研究中的应用(四四)在遣传性疾病研究中的应用在遣传性疾病研究中的应用(五五)在疾病防治方面的应用在疾病防治方面的
2、应用三、存在问题和前景三、存在问题和前景(一一)存在问题存在问题(二二)前景前景 流流行行病病学学是是研研究究人人群群中中疾疾病病和和健健康康的的分分布布，探探索索影影响响分分布布的的因因素素，并并在在此此基基础础上上制制定定预预防防策策略略的的措措施施的的一一门门学学科科。一一直直以以来来，流流行行病病学学在在疾疾病病的的预预防防和和治治疗疗，疾疾病病危危险险因因素素的的研研究究和和控控制制方方面面都都起起着着十十分分重重要要的的作作用用。近近二二三三十十年年来来，生生物物学学技技术术尤尤其其是是分分子子生生物物学学技技术术取取得得了了突突破破性性进进展展，并并逐逐渐渐渗渗透透到到各各个个医
3、医学学领领域域。分分子子生生物物学学的的理理论论和和技技术术不不断断应应用用于于传传统统的的流流行行病病学学，并并在在此此基基础础上上形形成成了一门新的分支学科了一门新的分支学科分子流行病学分子流行病学。一、分子流行病学概述一、分子流行病学概述（一）定义（一）定义 分分子子流流行行病病学学是是应应用用先先进进的的实实验验技技术术测测量量生生物物学学标标志志，结结合合流流行行病病学学现现场场研研究究方方法法，从从分分子子水水平平阐阐明明疾疾病病的的病病因因及及其其相相关关的的致致病病过过程程，并并提提出出与与评评价价相相应应防防治治措措施施的的科科学学。这这一一定定义义包包含含了了几几个个要要点
4、点：（1）分分子子流流行行病病学学是是流流行行病病学学的的一一个个分分支支，是是传传统统流流行行病病学学与与新新兴兴的的生生物物学学技技术术，特特别别是是分分子子生生物物学学技技术术之之间间的的一一门门边边缘缘学学科科、交交叉叉学学科科；（2）分分子子流流行行病病学学的的主主要要研研究究对对象象是是各各种种生生物物学学标标志志；（3）与与传传统统流流行行病病学学不不同同，分分子子流流行行病病学学还还研研究究暴暴露露因因子子引引起起疾疾病病的的相相关关过过程程，以以测测定定各各种种易易感感性性标标志志，并并提提出出针针对对性性预预防防措措施施，尤尤其其是是阻阻断断暴暴露露因因子子进进入入体体内内
5、后后致致病病进进程程的初级预防措施。的初级预防措施。图图1传统流行病学与分子流行病学的关系（传统流行病学与分子流行病学的关系（Schulte，1993）表表1传统和分子流行病学的比较传统和分子流行病学的比较传统流行病学传统流行病学分子流行病学分子流行病学推动力推动力公共卫生公共卫生现代科学现代科学研究水平研究水平人群人群个体个体/器官组织器官组织/细胞细胞/分分子子研究样式研究样式人口统计学人口统计学/社会科学社会科学临床临床/实验实验认识论策略认识论策略自上而下自上而下自下而上自下而上预测水平预测水平人群人群个体个体 综综合合上上述述国国内内外外学学者者的的分分子子流流行行病病学学研研究究实
6、实践践及及其其对对分分子子流流行行病病学学的的理理解解，提提出出如如下下定定义义：分分子子流流行行病病学学是是应应用用先先进进的的实实验验技技术术测测量量生生物物学学标标志志，结结合合流流行行病病学学现现场场研研究究方方法法，从从分分子子水水平平阐阐明明疾疾病病的的病病因因及及其其相相关关的的致致病病过过程程，并并提提出出与与评评价价相相应防制措施的科学。应防制措施的科学。1疾病病因的探讨疾病病因的探讨疾疾病病的的发发生生，大大多多是是环环境境因因素素与与遗遗传传因因素素同同时时起起作作用用。只只是是有有些些疾疾病病以以环环境境因因素素为为主主，有有些些则则正正好好相相反反。遗遗传传因因素素起
7、起重重要要作作用用的的疾疾病病往往往往与与基基因因有有关关，这这不不言言而而喻喻；而而很很多多与与环环境境因因素素有有关关的的疾疾病病，也也常常常常需需从从基基因因方方面面去去研研究究，因因为为环环境境因因素素可可以以通通过过宿宿主主的的基基因因突突变变或或异异常常表表达达引引起起疾疾病病。因因此此，分分子子流流行行病病学学研研究究在在这这方面起着非常重要的作用。方面起着非常重要的作用。（二）分子流行病学研究内容和范围（二）分子流行病学研究内容和范围 意意大大利利学学者者Dragani在在1996年年名名古古屋屋会会议议上上报报告告，以以前前一一般般认认为为肺肺癌癌的的家家庭庭聚聚集集性性很很
8、少少见见，故故基基因因因因素素的的作作用用很很小小。但但他他从从小小鼠鼠模模型型发发现现染染色色体体上上存存在在易易感感或或抑抑制制肺肺癌癌的的基基因因位位点点。此此后后作作者者在在人人群群中中选选择择病病理理确确诊诊的的肺肺腺腺癌癌125例例作作为为病病例例组组，另另在在健健康康供供血血员员人人群群中中随随机机选选择择179名名作作普普通通人人群群对对照照检检测测显显示示，在在KRAS2基基因因第第2外外显显子子下下游游有有个个基基因因位位点点与与拮拮抗抗肺肺癌癌产产生并延长肺癌患者的生存期有关。生并延长肺癌患者的生存期有关。表表2肺腺癌病人和普通人群对照中肺腺癌病人和普通人群对照中KRAS
9、2Rsal等位等位基因的基因型频率基因的基因型频率基因型基因型a普通人群普通人群肺腺癌肺腺癌观察数观察数期望数期望数bA1/A1A1/A2A2/A29668158959481.557.812.7计计179152152注：注：a：等位基因等位基因A1为无酶切位点；为无酶切位点；A2为有酶切位点；为有酶切位点；b：按普通人群的频率推算所得；按普通人群的频率推算所得；c：卡方检验卡方检验=0.025。2危险因子致病机制的研究危险因子致病机制的研究分分子子流流行行病病学学不不仅仅研研究究环环境境与与宿宿主主体体内内的的致致病病因因子子，而而且且着着重重研研究究这这些些致致病病的的危危险险因因素素，特特
10、别别是是化化学学物物质质与与生生物物活活性性物物质质从从暴暴露露开开始始至至疾疾病病发发生生全全过过程程的的各个环节。各个环节。癌癌症症发发病病的的分分子子流流行行病病学学研研究究是是个个典典型型的的例例子子。20多多年年来来，对对与与癌癌相相关关的的各各种种生生物物学学标标志志，致致癌癌物物的的种种种种生生物物效效应应标标志志，如如DNA加加成成物物（adduct）等等等等进进行行了了十十分分广广泛泛的的研研究究，有有关关报报道道相相当当丰丰富富，积积累累了了很很多多资资料料，提提出出了了一一些些很很有有意意义义的的假假设设。目目前前认认为为，致致癌癌化化学学因因子子进进入入体体内内，最最终
11、终引引起起临临床床癌癌症症过过程程的的基基本本框框架架大大致致如如下下。致致癌癌作作用用是是多多阶阶段段的的，正正常常细细胞胞转转变变为为癌癌细细胞胞经经历历了了致致癌癌作作用用累累积积而而又又连连续续的的几几个个阶阶段段：启启动动（initiation）、促促 进进（promotion），转转 化化（conversion）和和 发发 展展（progression）。在在启启动动阶阶段段，机机体体暴暴露露于于环环境境致致癌癌化化学学物物质质，致致癌癌物物进进入入体体内内需需经经代代谢谢活活化化（metabolicactivation），变变成成反反应应性性亲亲电电物物质质（reactiveel
12、ectrophilicform），再再与与DNA反反应应形形成成DNA加加成成物物。在在致致癌癌物物进进入入体体内内后后，这这种种反反应应通通常常仅仅需需几几小小时时就就可可完完成成。当当DNA复复制制时时，这这种种对对DNA的的化化学学损损伤伤可可引引起起基基因因的的变变化化，这这些些基基因因的的变变化化如如果果逃逃避避了了DNA修修复复作作用用，就就会会被被固固定定下下来来。某某些些基基因因损损伤伤可可造造成成癌癌基基因因的的活活化化或或抑抑癌癌基基因因的的失失活活，从从而而使使正正常常细细胞胞变变成成启启动动细细胞胞。这这个个过过程程往往往往仅仅需需几几天天时时间间。但但促促进进过过程程
13、却却是是人人类类致致癌癌过过程程中中最最长长的的阶阶段段，启启动动细细胞胞呈呈克克隆隆样样扩扩展展需需10年年甚甚至至更更长长。促促进进阶阶段段的的细细胞胞还还需需经经过过进进一一步步的的基基因因改改变变，并并获获得得侵侵袭袭性性与与转转移移的的恶恶性性表表型型，才才能能进进入入转转化化与与发发展展阶阶段段，而而这这后后2个阶段大概需个阶段大概需12年的时间。年的时间。图图2分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略3疾病易感性的测定疾病易感性的测定个个体体对对疾疾病病都都存存在在一一定定的的感感受受性性，称称之之为为易易感感性性。以以往往一一般般认认
14、为为，只只有有传传染染病病才才有有确确定定的的易易感感性性，可可以以用用测测定定机机体体内内是是否否存存在在某某种种特特异异性性保保护护（中中和和）抗抗体体的的方方法法了了解解其其对对某某种种传传染染病病是是否否具具有有易易感感性性或或免免疫疫力力。然然而而，近近来来分分子子生生物物学学与与免免疫疫学学研研究究发发现现，机机体体对对很很多多疾疾病病也也同同样样存存在在着着易易感感性性，且且往往往往与与个个体体的的某某些些基基因因型型别别或或序序列列或或其其表表达达产产物物有有关关，如如果果与与遗遗传传有有联联系系，往往往往称称之之为为遗遗传传易易感感性性（尤尤其其慢慢性性病病）。同同时时还还发
15、发现现很很多多传传染染性性疾疾病病的的易易感感性性，除除了了与与能能刺刺激激机机体体产产生生特特异异性性抗抗体体的的致致病病微微生生物物有有关关外外，也也和和机机体体的的某某些些基基因因类类型型有有联联系系，因因为为后后者者决决定定了了机机体体对对致致病病微微生物的免疫反应的方式与强度。生物的免疫反应的方式与强度。对于常见的慢性疾病的遗传易感性的分析，对于常见的慢性疾病的遗传易感性的分析，可以应用同时检测特异基因标志的病例对照研究可以应用同时检测特异基因标志的病例对照研究进行。例如，如果某个特异性的等位基因在某病进行。例如，如果某个特异性的等位基因在某病病人中明显高于对照，这就提示该等位基因的
16、存病人中明显高于对照，这就提示该等位基因的存在可能使机体对某病具有一定的易感性。目前，在可能使机体对某病具有一定的易感性。目前，与遗传易感性相关研究较多的一个基因区域是人与遗传易感性相关研究较多的一个基因区域是人类第类第6号染色体短臂上的人类白细胞抗原号染色体短臂上的人类白细胞抗原（HLA），），其原因可能有二，其原因可能有二，首先首先HLA基因区基因区有高度的多态性，其次为有高度的多态性，其次为HLA的功能是介导对的功能是介导对特异性抗原的免疫反应。特异性抗原的免疫反应。Erlich的研究发现，的研究发现，HLA类单倍体（类单倍体（DRB11501-DQB10602）的比例在受到人乳头瘤状病
17、毒（的比例在受到人乳头瘤状病毒（HPV）16型感型感染的宫颈癌与重度异常增生的病人中明显升高。染的宫颈癌与重度异常增生的病人中明显升高。4流行规律的研究流行规律的研究这这方方面面研研究究最最多多的的是是传传染染病病。在在传传播播范范围围的的确确定定，传传播播途途径径的的判判断断与与传传染染源源的的追追索索方方面面，分分子子流流行行病病学学可可以以发发挥挥无无与与伦伦比比的的作作用用。因因为为以以往往常常常常是是根根据据宏宏观观流流行行病病学学调调查查分分析析，再再辅辅以以病病原原体体分分离离与与血血清清学学分分型型来来分分析析流流行行规规律律。然然而而近近年年的的很很多多分分子子流流行行病病学
18、学的的研研究究表表明明，上上述述的的方方法法有有时时不不够够精精确确。例例如如，尽尽管管传传染染源源与与接接触触者者之之间间的的病病原原体体的的血血清清学学型型别别一一致致，但但如如果果基基因因型型不不一一致致，就就不不能能确确切切判判定定两两者者的的传传播播关系。关系。（1）传播范围的确定）传播范围的确定按照传染病流行病按照传染病流行病学基本理论，在一次爆发或流行中，其受染范学基本理论，在一次爆发或流行中，其受染范围的确定应根据如下原则：在爆发或流行期间，围的确定应根据如下原则：在爆发或流行期间，有共同或有效暴露史，经过一个平均潜伏期发有共同或有效暴露史，经过一个平均潜伏期发病或出现急性感染
19、的生物学标志可判定为受染病或出现急性感染的生物学标志可判定为受染者，然后总计受染人员，结合这些人员活动的者，然后总计受染人员，结合这些人员活动的区域，以确定受染或流行涉及范围。可是，过区域，以确定受染或流行涉及范围。可是，过去测定的生物学标志主要是属于血清学、免疫去测定的生物学标志主要是属于血清学、免疫学、微生物学范围，缺乏基因型标志，因而可学、微生物学范围，缺乏基因型标志，因而可能出现错误的判断。分子流行病学研究缩小了能出现错误的判断。分子流行病学研究缩小了常规流行病学调查所推测受染范围，从基因水常规流行病学调查所推测受染范围，从基因水平上证实爆发的受染人数与传染来源。平上证实爆发的受染人数
20、与传染来源。（2）传播途径的判定）传播途径的判定以往，传染病流行中传播途径或传以往，传染病流行中传播途径或传播媒介的调查通常使用排除法，同时尽可能在媒介物中分离播媒介的调查通常使用排除法，同时尽可能在媒介物中分离到引起流行的病原体或检测到病原学标志。近来分子流行病到引起流行的病原体或检测到病原学标志。近来分子流行病学研究引入一些新的技术，如分子进化诊断（学研究引入一些新的技术，如分子进化诊断（molecularevolutionarydiagnosis）。）。例如，不少分析性流行病学研究与例如，不少分析性流行病学研究与血清流行病学研究均认为丙肝病毒（血清流行病学研究均认为丙肝病毒（HCV）可经
21、性传播途径可经性传播途径感染配偶。然而，出人意料的是，在感染配偶。然而，出人意料的是，在1993年东京国际病毒性年东京国际病毒性肝炎会议有肝炎会议有2篇报道，用分子进化法进行的研究提出了相反的篇报道，用分子进化法进行的研究提出了相反的意见。如意见。如Ohno筛检筛检50对至少有一方抗对至少有一方抗-HCV阳性的夫妇，发阳性的夫妇，发现仅现仅4对夫妇双方抗对夫妇双方抗-HCV均阳性。用均阳性。用PCR扩增、测序分型，扩增、测序分型，结果其中结果其中2对配偶男女之间的对配偶男女之间的HCVRNA彼此的基因型别不同，彼此的基因型别不同，由此可排除性传播所至；另由此可排除性传播所至；另2对夫妇之间型别
22、相同，用分子进对夫妇之间型别相同，用分子进化诊断判定男女病毒株的分株时间（化诊断判定男女病毒株的分株时间（divergencetime），），发现发现第第1对配偶的分株时间发生在对配偶的分株时间发生在4552年前，而结婚却才年前，而结婚却才32年；年；第第2对配偶分株时间已有对配偶分株时间已有3034年，结婚时间则在年，结婚时间则在25年前。基年前。基于这些研究结果，作者认为于这些研究结果，作者认为HCV经性传播的可能性很小。经性传播的可能性很小。（3）传传染染源源的的追追索索判判定定传传染染来来源源或或两两人人之之间间的的传传播播关关系系应应符符合合如如下下4条条原原则则：A（传传染染源源）
23、与与B（受受染染者者）的的接接触触是是有有效效接接触触（暴暴露露）；接接触触发发生生在在A的的传传染染期期内内；B的的发发病病时时间间是是在在暴暴露露后后该该病病最最短短与与最最长长潜潜伏伏期期之之间间；A与与B受受染染致致病病的的血血清清学学型型别别一一致致。如如今今看看来来，第第条条应应该该用用基基因因型型别别来来代代替替，而而基基因因序序列列的的测测定定与与型型别别差差异异的的鉴鉴定定虽虽然然比比较较复复杂杂与与精精细细，但可靠得多。但可靠得多。美国美国19901991年报道佛罗里达一个口腔年报道佛罗里达一个口腔诊所有诊所有1名患有艾滋病的牙医，被他看过病的名患有艾滋病的牙医，被他看过病
24、的患者中有患者中有7名后来感染了名后来感染了HIV，然而经过分子流然而经过分子流行病学研究发现，其中行病学研究发现，其中5名患者的名患者的HIV与牙医的与牙医的HIV有共同的氨基酸特异模式（有共同的氨基酸特异模式（signaturepattern），），而且序列的差异率而且序列的差异率 5.0%，为同一，为同一病毒株；而另病毒株；而另2名患者的名患者的HIV则与牙医的不同。则与牙医的不同。因此，通过序列分析，从分子水平确定了前因此，通过序列分析，从分子水平确定了前5名病人的名病人的HIV感染是由牙医引起，而后感染是由牙医引起，而后2名病人名病人的传染来源则不是牙医。的传染来源则不是牙医。5防制
25、措施的研究防制措施的研究（1）传传染染病病预预防防因因为为在在传传染染病病流流行行的的研研究究中中应应用用了了分分子子生生物物学学等等现现代代技技术术，对对传传播播与与流流行行范范围围的的确确定定，传传播播途途径径、传传播播媒媒介介与与因因子子以以及及传传染染来来源源的的推推断断更更为为精精确确，所所以提出的控制措施更有针对性，更有成效。以提出的控制措施更有针对性，更有成效。传传染染病病预预防防中中最最可可靠靠的的手手段段是是疫疫苗苗接接种种。已已有有很很多多传传染染病病由由于于实实施施了了安安全全、有有效效、广广泛泛的的免免疫疫接接种种，发发病病率率已已大幅度地下降。大幅度地下降。但但少少数
26、数疫疫苗苗由由于于某某些些原原因因可可以以使使极极个个别别疫疫苗苗接接种种者者发发生生被被免免疫疫的的疾疾病病。过过去去，仅仅能能根根据据接接种种史史与与分分离离病病原原体体作作血血清清学学或或生生化化反反应应来来进进行行判判断断，但但可可靠靠性性不不强强。而而现现在在用用分分子子生生物物学学技技术术作作基基因因序序列列分分析析可可以以确确实实地地判判定定是是否否为为疫疫苗株引起的发病。苗株引起的发病。（2）非非传传染染病病的的预预防防由由于于分分子子流流行行病病学学不不仅仅研研究究疾疾病病的的危危险险因因素素，而而且且研研究究其其引引起起疾疾病病整整个个过过程程中中的的所所有有环环节节，也也
27、即即研研究究这这些些致致病病因因子子的的致致病病机机制制，因因此此，这这就就为为疾疾病病的的三三级级预预防防特特别别是是第第I、II级级预预防防采采取取针针对对性性措措施施奠奠定定了了科科学学的的基基础础。在在这这个个意意义义上上也也可可以以说说，分分子子流流行行病病学学的的建建立立，为为疾疾病病的的三三级级预预防防开开辟辟了了十十分分广阔的前景。广阔的前景。图图-2以以癌癌症症为为例例，描描绘绘了了应应用用分分子子流流行行病病学学方方法法研研究究致致癌癌因因子子导导致致正正常常细细胞胞基基因因改改变变=选选择择性性克克隆隆扩扩增增=基基因因改改变变=细细胞胞异异质质化化=临临床床癌癌症症过过
28、程程的的主主要要阶阶段段，以以及及针针对对这这些些改改变变所所能能采采取取的的不不同同阶阶段段的的具具体体预预防防与与干干预预措措施施：防防止止暴暴露露、预预防防最最终终致致癌癌因因子子的的形形成成、阻阻断断其其与与宿宿主主基基因因间间的的相相互互作作用用、抑抑制制癌癌前前起起始始或或启启动动细细胞胞的的产产生生、抑抑制制选选择择性性克克隆隆的的扩扩散散、早早期期诊诊断断、手手术术与与放射治疗、化学治疗；预防复发与继发肿瘤。图图2分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略l 分分子子流流行行病病学学在在某某种种意意义义上上讲讲，是是一一种种流流行行病病
29、学学宏宏观观与与实实验验室室微微观观结结合合的的方方法法学学，需需要要现现场场流流行行病病学学调调查查研研究究与与实实验验室室先先进进的的检检测测技技术术相相结结合合。因因此此，分分子子流流行行病病学学的的研研究究方方法法大大致致可可以以分分为为二二大大类类：实实验验室室技技术术与与流流行行病病学学现现场场研研究究方法。方法。（三）分子流行病学常用的主要研究方法（三）分子流行病学常用的主要研究方法（三）分子流行病学常用的主要研究方法（三）分子流行病学常用的主要研究方法1实验技术实验技术 （1）基因序列分析）基因序列分析通过需测定的基因通过需测定的基因（靶基因）序列提取，克隆入测序载体或用（靶基
30、因）序列提取，克隆入测序载体或用PCR直接电泳测序。这是测定基因核酸序列及直接电泳测序。这是测定基因核酸序列及其类型、突变部位与方式的最可靠的方法，在其类型、突变部位与方式的最可靠的方法，在传染病与非传染病分子流行病学研究中都十分传染病与非传染病分子流行病学研究中都十分常用。但技术操作比较复杂，分析也需细致并常用。但技术操作比较复杂，分析也需细致并具备一定经验，在国内，目前还只在一些大学、具备一定经验，在国内，目前还只在一些大学、研究所、大医院等开展，表研究所、大医院等开展，表3常用检测基因变常用检测基因变异方法。异方法。表表3基因变异的检测和筛查方法比较基因变异的检测和筛查方法比较方法方法P
31、CR应用应用变异部位和变异部位和内容确定内容确定检出率（检出率（%）主要特点主要特点1Southern印迹杂交印迹杂交2核酸序列分析（测序）核酸序列分析（测序）3ASO探针杂交探针杂交4RNaseA裂解裂解5化学裂解化学裂解6变性梯度胶电泳变性梯度胶电泳（DGGE）7单链构象多态分析单链构象多态分析（SSCP）8多重多重PCR9PCR-RFLP10 等等 位位 基基 因因 特特 异异 性性PCR-+CAABBCCAAA 5010090607010050100809598-95适适于于重重排排和和大大于于50100bp的缺失或插入的缺失或插入准准确确、可可靠靠，技技术术条条件件要要求高求高检测已
32、知变异，范围小检测已知变异，范围小适适于于已已知知和和未未知知变变异异，有有假阴性、假阳性结果假阴性、假阳性结果适适于于已已知知和和未未知知变变异异，检检出率高，使用毒性试剂出率高，使用毒性试剂高高效效检检出出基基因因变变异异，使使用用特殊仪器特殊仪器简简便便、快快速速，适适于于大大样样本本筛查，可有假阴性结果筛查，可有假阴性结果适适于于多多发发、大大范范围围基基因因缺缺失失检检测测改改变变限限制制酶酶切切点点的的基基因变异因变异检检测测已已知知基基因因变变异异，有有假假阴性、假阳性结果阴性、假阳性结果注：注：+可用，可用，不宜用；不宜用；A完全确定；完全确定；B不完全确定；不完全确定；C不能
33、确定。不能确定。（2）分分 子子 进进 化化 分分 析析（molecular evolutionaryanalysis）用用核核酸酸序序列列测测定定技技术术结结合合计计算算机机分分析析，确确定定流流行行中中感感染染的的病病原原株株之之间间的的亲亲缘缘关关系系和和序序列列突突变变时时其其时时间间，以以研研究究传传播播关关系系和和病病原原体体的的进进化化。所所以以目目前前主主要要用用于传染病的研究。于传染病的研究。（3）单链构象多态性（）单链构象多态性（single-strandconformationpolymorphism，SSCP）分析分析其简要操作步骤与原理为：其简要操作步骤与原理为：将被
34、检的靶基因将被检的靶基因PCR扩增后变性为单链核酸，然后进行扩增后变性为单链核酸，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察区带的迁移率。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察区带的迁移率。由于由于迁移率与核酸的构象密切相关，甚至迁移率与核酸的构象密切相关，甚至1个碱基的突变都可个碱基的突变都可以改变构象，产生电泳迁移率的差异。因此，藉此可以以改变构象，产生电泳迁移率的差异。因此，藉此可以检出基因的突变，而不需要测序。检出基因的突变，而不需要测序。SSCP简便，价格便宜，简便，价格便宜，已被很多学者应用传染病与非传染病的研究。国内也有已被很多学者应用传染病与非传染病的研究。国内也有些单位在使用，然而由于影
35、响因素多，需要操作技术熟些单位在使用，然而由于影响因素多，需要操作技术熟练，重复性差，尚未被普遍使用。另外，练，重复性差，尚未被普遍使用。另外，SSCP不能判断不能判断DNA变异的确切部位与方式，如要作深入研究，还需进变异的确切部位与方式，如要作深入研究，还需进行序列测定。行序列测定。（4）基基因因芯芯片片技技术术（DNAchip）基基因因芯芯片片是是指指固固定定有有许许多多有有序序列列的的寡寡核核甘甘酸酸探探针针的的载载体体，通通过过杂杂交交检检测测，对对各各种种基基因因进进行行分分析析。由由于于它它所所具具有有的的高高通通量量性性、快快速速、敏敏感感、便便宜宜等等优优点点，在在多多个个领领
36、域域起起到到越越来来越越重重要要的的作作用用。基基因因芯芯片片基基本本原原理理是是通通过过原原位位杂杂交交方方法法，用用已已知知的的DNA序序列列检检测测未未知知序序列列。目目前前主主要要用用于于DNA突突变变分分析析，基基因因谱谱差差异异分分析析，基基因因诊诊断断分分析析和和大大规规模模基基因因类类型型分分析析。其其研研制制技技术术主主要要包包括括以以下下几几大大步步骤骤：寡寡核核苷苷酸酸探探针针合合成、固定、杂交和检测。成、固定、杂交和检测。2现场分子流行病学研究方法现场分子流行病学研究方法传传统统的的现现场场流流行行病病学学研研究究方方法法，即即描描述述性性研研究究，分分析析性性研研究究
37、与与干干预预性性研研究究均均可可应应用用于于分分子子流流行行病病学学。也也可可以以说说，在在传传统统的的流流行行病病学学研研究究中中，结结合合检检测测一一些些生生物物学学标标志志，以以从从分分子子水水平平更更深深层层次次揭揭示示病病因因联联系系或或致致病病因因子子的的致致病病机机制制。目目前较常用有前较常用有2种。种。（1）巢巢式式（套套式式、嵌嵌入入式式）病病例例对对照照研研究究（nestedcasecontrolstudy）运运作作开开始始是是按按队队列列研研究究的的方方式式进进行行：选选择择一一队队列列，收收集集基基线线资资料料，采采集集所所需需研研究究的的生生物物学学标标志志的的组组织
38、织或或体体液液标标本本储储存存备备用用，然然后后随随访访到到出出现现能能满满足足病病例例对对照照研研究究样样本本量量的的病病例例数数为为止止。把把这这些些病病例例作作为为病病例例组组，按按配配比比条条件件，从从同同一一队队列列中中选选择择1或或数数个个非非病病例例作作对对照照，抽抽出出病病例例与与对对照照的的基基线线资资料料并并检检测测收收集集的的标标本本，资资料料按按配配比比病病例例对对照照研研究究处处理理，其其他他的的非非病病例例及及其其资资料料，标标本本均均可可不不用用。由由于于此此种种研研究究是是按按队队列列研研究究设设计计进进行行，资资料料收收集集和和生生物物标标本本采采集集均均在在
39、发发病病前前，观观察察的的又又是是生生物物学学标标志志，故故因因果果关关系系清清楚楚，资资料料可可靠靠，论论证证强强度度高高；而而标标本本检检测测与与资资料料处处理理又又按按病病例例对对照照研研究究方方法法，故故省省钱钱省省时时省省力力，可可以以说说兼兼有有队队列研究与病例对照研究两者之优点。列研究与病例对照研究两者之优点。（2）病例）病例-病例研究（病例研究（case-casestudy）在病例对照研在病例对照研究的病例组中，临床类型可以不同，如脑卒中有出血型、缺究的病例组中，临床类型可以不同，如脑卒中有出血型、缺血型，冠心病有心梗型、无心梗型；某些生物学标志往往也血型，冠心病有心梗型、无心
40、梗型；某些生物学标志往往也是不均一的，即部分病例有某种生物学标志，而其余的则没是不均一的，即部分病例有某种生物学标志，而其余的则没有。那么就可把不同的临床类型或具有标志的这些病例与无有。那么就可把不同的临床类型或具有标志的这些病例与无标志的病例，按病例对照研究的方式处理资料，以探讨不同标志的病例，按病例对照研究的方式处理资料，以探讨不同临床类型的危险因素的差异或者这个生物学标志与该疾病的临床类型的危险因素的差异或者这个生物学标志与该疾病的其他危险因素之间的关系和相互作用。这就能比普通病例对其他危险因素之间的关系和相互作用。这就能比普通病例对照研究提供更多的信息与线索。在病例对照研究的基础上再照
41、研究提供更多的信息与线索。在病例对照研究的基础上再作如此处理，可达到事半功倍之效。或者使用单纯病例作如此处理，可达到事半功倍之效。或者使用单纯病例-病病例研究可免除选择对照，特别是免除从无病对照中采取生物例研究可免除选择对照，特别是免除从无病对照中采取生物标本的麻烦与困难。如食管癌的病例对照研究中发现，标本的麻烦与困难。如食管癌的病例对照研究中发现，130例食管癌患者中，用免疫组化检测到例食管癌患者中，用免疫组化检测到p53基因表达异常的有基因表达异常的有68例，按病例例，按病例-病例研究处理，无论是单因素或病例研究处理，无论是单因素或Logistic回归回归分析，均显示吸烟、食管癌家庭史与分
42、析，均显示吸烟、食管癌家庭史与p53基因表达异常有关，基因表达异常有关，OR值分别为值分别为2.33.2和和2.83.8；吸烟还有剂量效应，表明吸；吸烟还有剂量效应，表明吸烟与食管癌家族史很可能是食管癌烟与食管癌家族史很可能是食管癌p53基因异常表达的危险基因异常表达的危险因素。因素。二、我国分子流行病学研究现状二、我国分子流行病学研究现状 国内自国内自1985年始，将分子生物学技术和年始，将分子生物学技术和方法：方法：DNA杂交、基因酶切图谱分析、序列分杂交、基因酶切图谱分析、序列分析（析（DNA、AAA）和和PCR等技术应用于流行等技术应用于流行病学中疾病诊断以及追踪传染源的调查研究。病学
43、中疾病诊断以及追踪传染源的调查研究。使疾病早期快速、可靠的基因诊断提供了手段，使疾病早期快速、可靠的基因诊断提供了手段，而且使基因分离、克隆表达与序列分析等技术而且使基因分离、克隆表达与序列分析等技术更加简便、高效。另一方面由于流行病学研究更加简便、高效。另一方面由于流行病学研究的深入，一些传统的表型（的深入，一些传统的表型（Phenotype）检测检测方法。如染色、形态、培养特征、生化反应、方法。如染色、形态、培养特征、生化反应、血清学试验等已不能完全满足疾病的病因与传血清学试验等已不能完全满足疾病的病因与传播途径精确判别的需要，也不能完全适应一些播途径精确判别的需要，也不能完全适应一些非传
44、染性疾病病因及制病制理的探讨。因此，非传染性疾病病因及制病制理的探讨。因此，在短短的十几年中，国内分子流行病学经历了在短短的十几年中，国内分子流行病学经历了由产生到起步发展的过程，并取得重大发展。由产生到起步发展的过程，并取得重大发展。（一一）病病原原体体分分型型和和检检测测研研究究分分子子流流行行病病学学研研究究最最早早开开始始用用于于传传染染病病的的病病原原体体基基因因分分型型，并并调调查查病病原原体体的的分分布布规规律律。在在传传染染流流行行中中，对对病病原原体体进进行行准准确确的的分分型型，对对疾疾病病的的防防治治十十分分重重要要。由由于于病病原原体体表表型型特特征征的的不不稳稳定定性
45、性和和易易变变性性，以以表表型型特特征征研研究究的的分分型型方方法法，如如血血清清学学、生生化化学学等等，就就存存在在缺缺陷陷。而而基基因因型型是是遗遗传传特特征征，相相当当稳稳定定可可靠靠，可可以以作作为为病病原原体体鉴鉴定定和和诊诊断断的的重重要要依依据据。细细菌菌的的产产毒毒、耐耐药药特特性性都都与与细细菌菌质质粒粒有有关关，徐徐兆兆炜炜等等（1986年年）对对在在同同一一地地区区分分离离的的134株株痢痢疾疾杆杆菌菌进进行行质质粒粒图图谱谱分分析析，发发现现虽虽然然部部分分菌菌株株耐耐药药谱谱不不同同，但但仍仍可可呈呈现现为为相相同同的的质质粒粒图图谱谱，这这对对鉴鉴定定菌菌株株，追追
46、踪踪耐耐药药菌菌株株来来源源极极有有帮帮助助。rRNA基基因因是是细细菌菌染染色色体体上上编编码码rRNA的的DNA序序列列，属属保保守守基基因因序序列列。徐徐文文斌斌等等（1996年年）对对不不同同地地区区、不不同同时时间间分分离离到到的的119株株伤伤寒寒沙沙门门氏氏菌菌进进行行rRNA(RTs)的的基基因因多多态态性性分分析析，119株株细细菌菌可可分分为为38个个RTs，其其中中RT9和和RT11是是造造成成我我国国伤伤寒寒流流行行的的主主要要RTs。对对于于病病毒毒的的分分型型，可可以以采采取取先先进进行行病病毒毒的的细细胞胞培培养养，病病毒毒增增殖殖到到一一定定程程度度后后，提提取
47、取病病毒毒DNA，再进行限制性内切图谱分析。再进行限制性内切图谱分析。PCR技术的出现，使对病原体分析过程更技术的出现，使对病原体分析过程更加简化、快捷。首先设计引物，加简化、快捷。首先设计引物，PCR扩增病原扩增病原体体DNA中一段保守的基因片段，然后进行酶切中一段保守的基因片段，然后进行酶切分析。例如，苏虹等（分析。例如，苏虹等（1997年）利用逆转录年）利用逆转录-多多聚酶链反应（聚酶链反应（RT-PCR）和限制性片段长度多态和限制性片段长度多态性（性（RFLP）分析安徽分析安徽HCV基因型的分布，结基因型的分布，结果表明，安徽果表明，安徽HCV感染以感染以II型为主，其中北部型为主，其
48、中北部地区地区III型感染多于南部，而型感染多于南部，而II型北部少于南部。型北部少于南部。对病原体的基因型、多态性、变异型可以应用对病原体的基因型、多态性、变异型可以应用单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）、）、脉冲场电泳脉冲场电泳（PFGE）以及序列分析等多种方法进行分析。以及序列分析等多种方法进行分析。基基因因的的多多态态性性也也表表现现为为酶酶分分子子的的多多态态性性，对对酶酶分分子子的的多多态态性性的的研研究究，也也可可了了解解不不同同病病原原体体间间遗遗传传关关系系、分分类类分分型型。段段广广才才等等（1996年年）应应用用多多位位点点酶酶电电泳泳法法（MEE）对对471株株
49、霍霍乱乱弧弧菌菌进进行行分分类类，结结果果证证实实古古典典型型和和埃埃尔尔托托型型流流行行株株遗遗传传关关系系紧紧密密；非非流流行行株株相相互互间间流流行行关关系系较较远远。O139群群与与O1群群流行株有相同的霍乱毒素（流行株有相同的霍乱毒素（CT）片段，应按流行株对待。片段，应按流行株对待。对对病病原原体体的的检检测测，以以往往多多使使用用病病原原体体培培养养、生生化化分分析析、血血清清学学和和免免疫疫学学检检测测等等，上上述述方方法法都都存存在在各各种种缺缺陷陷，如如检检测测时时间间长长、灵灵敏敏度度、特特异异度度不不高高等等。利利用用放放射射性性同同位位素素标标记记探探针针检检测测病病
50、原原体体，是是一一种种灵灵敏敏、特特异异的的检检测测方方法法。除除用用同同位位素素标标记记探探针针外外，更更多多的的使使用用非非同同位位素素如如地地高高辛辛、生生物物素素等等标标记记探探针针，增增加加了了安安全全性性。核核酸酸分分子子杂杂交交方方法法检检测测病病原原体体，在在流流行行病病学学研研究究中中应应用用日日益益增增多多。王王云云飞飞等等（1994年年）对对不不同同基基因因型型人人乳乳头头瘤瘤病病毒毒（HPV）在在宫宫颈颈癌癌、尖尖锐锐湿湿疣疣等等中中起起不不同同作作用用进进行行了了研研究究，证证明明HPV11/6型型引引起起性性传传播播的的尖尖锐锐湿湿疣疣；而而HPV16/18型型则则