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1、【南昌大学】优质课全国特级教师江新欢博士教授食品微生物学食品微生物学第四章第四章 非细胞微生物非细胞微生物 病毒病毒南昌大学食品院食品微生物组第四章第四章 非细胞微生物非细胞微生物 病毒病毒acellular organization Virusesn 第一节第一节 概述概述n 第二节第二节 病毒的形态结构病毒的形态结构n 第三节第三节 病毒的复制病毒的复制n 第四节第四节 病毒的检出与定量病毒的检出与定量n 第五节第五节 病毒与实践病毒与实践南昌大学食品院食品微生物组第一节第一节 概述概述一、病毒的发现和研究历史1886年，A.Mayer发现具有传染性的烟草花叶病；1892年，D.Ivano
2、vsky烟草花叶病病原体能通过细菌滤器：一种能通过细菌滤器的”细菌毒素”或极小的细菌南昌大学食品院食品微生物组1898年，M W Beijerinck对烟草花叶病病原体的研究结果：t能通过细菌滤器；t可被乙醇沉淀而不失去其感染性，t能在琼脂凝胶中扩散；t用培养细菌的方法不能被培养出来，推测只能在植物活细胞中生活；比细菌小的具有传染性的活的流质（contagiumvivumfluidum）南昌大学食品院食品微生物组1900年前后，包括口蹄疫（footandmouthdisease）(Loeffer和Frosch发现，1989年)在内的多种动植物疾病病原体的滤过性特性被证明。filterablev
3、iruses（滤过性病毒）viruses（病毒）FWTwort（1915年）、FdHerelle（1917年），分别发现细菌（Shigella dysenteriae）病毒bacteriophages噬菌体（phage）1935年，WMStanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)；Bawden等证明烟草花叶病毒的本质为核蛋白；1940年，Kausche首先用电镜观察到烟草花叶病毒颗粒；南昌大学食品院食品微生物组极大地丰富了现代生物学（微生物学、分子生物学、分子极大地丰富了现代生物学（微生物学、分子生物学、分子遗传学）的理论与技术；遗传学）的理论与技
4、术；病毒学（病毒学（viruology）：研究病毒（研究病毒（virus）的本质及其与）的本质及其与宿主的相互作用的科学，是微生物学的重要分支学科。宿主的相互作用的科学，是微生物学的重要分支学科。有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害；有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害；利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治；利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治；发展以基因工程为中心的生物高新技术产业；发展以基因工程为中心的生物高新技术产业；南昌大学食品院食品微生物组二、病毒的特点和定义1、特点1 1）不具有细胞结构，具有一般化学大分子的特征。）不具有细胞结构，具有一般化学大分子的特征。2 2）
5、一种病毒的毒粒内只含有一种核酸，）一种病毒的毒粒内只含有一种核酸，DNADNA或者或者RNARNA。3 3）大部分病毒没有酶或酶系极不完全，不含催化能量代谢）大部分病毒没有酶或酶系极不完全，不含催化能量代谢 的酶，不能进行独立的代谢作用。的酶，不能进行独立的代谢作用。4 4）严格的活细胞内寄生，没有自身的核糖体，没有个体生）严格的活细胞内寄生，没有自身的核糖体，没有个体生 长，也不进行二均分裂，必须依赖宿主细胞进行自身的长，也不进行二均分裂，必须依赖宿主细胞进行自身的 核酸复制，形成子代。核酸复制，形成子代。5 5）个体微小，在电子显微镜下才能看见。）个体微小，在电子显微镜下才能看见。6 6）
6、对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。南昌大学食品院食品微生物组病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。形式的独特生物类群。超显微的、没有细胞结构的、专性活细胞内寄生的实体南昌大学食品院食品微生物组细菌与病毒性质的比较南昌大学食品院食品微生物组2、定义病毒为具有独立于其宿主的进化史的绝对细胞内寄生物，它的DNA或RNA基因组被其所编码的蛋白质壳体化（encapsid
7、ation）。-（Fields等，1990年）非细胞生物（真）病毒：至少含核酸和蛋白质二种组分亚病毒类病毒：只含具侵染性的RNA组分卫星RNA：只含有不具侵染性的RNA组分朊病毒：只含蛋白质（euvirus）（subvirus)南昌大学食品院食品微生物组三、病毒的宿主范围病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性噬菌体（phage）、植物病毒（plantviruses）动物病毒（animalviruses）南昌大学食品院食品微生物组第二节第二节 病毒的形态结构病毒的形态结构病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细
8、胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。形式的独特生物类群。毒粒(virion)病毒颗粒(virusparticle)：病毒的细胞外颗粒形式，也是病毒的感染性形式。一团能够自主复制的遗传物质保护遗传物质免遭环境破坏，并作为将遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞的载体。蛋白质外壳包膜南昌大学食品院食品微生物组一、毒粒的形态结构1、病毒的大小和形状、病毒的大小和形状个体小，必需在电镜下观察；不同病毒的毒粒大小差别很大；毒粒的形状大致可分球形颗粒(或称拟球形颗粒)、杆状颗粒和复杂形状颗粒（如蝌蚪状，卵形）等少数几类
9、。南昌大学食品院食品微生物组病毒的形状南昌大学食品院食品微生物组病毒的形体微小，只能以nm计量，一般为10300nm。各种毒粒的大小、形态差异很大南昌大学食品院食品微生物组二、毒粒的化学组成毒粒（化学组成）核酸；蛋白质；脂类；碳水化合物；基本化学组成南昌大学食品院食品微生物组二、毒粒的化学组成1、病毒的核酸t核酸是病毒的遗传物质；t一种病毒的毒粒只含有一种核酸：DNA或是RNA；病毒核酸单链DNA（ssDNA）；双链DNA（dsDNA）；单链RNA（ssRNA）；双链RNA（dsRNA）；南昌大学食品院食品微生物组病毒的核酸类型病毒的核酸类型动物病毒动物病毒含含DNADNA双链双链牛痘病毒牛痘
10、病毒单链单链小鼠细小病毒小鼠细小病毒含含RNARNA双链双链呼肠弧病毒呼肠弧病毒单链单链脊髓灰质炎病毒脊髓灰质炎病毒植物病毒植物病毒含含RNARNA双链双链水稻矮缩病毒水稻矮缩病毒单链单链烟草花叶病毒烟草花叶病毒含含DNADNA双链双链花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒细菌病毒细菌病毒含含DNADNA双链双链大肠杆菌大肠杆菌T T系噬菌体系噬菌体单链单链大肠杆菌大肠杆菌X174X174，M13M13含含RNARNA单链单链大肠杆菌大肠杆菌f f2 2噬菌体噬菌体(5(5群群)南昌大学食品院食品微生物组核酸功能核酸功能：核酸功能核酸功能储存病毒的遗传信息储存病毒的遗传信息控制病毒的遗传变异控制病毒的遗
11、传变异控制病毒的增殖控制病毒的增殖控制病毒对宿主的感染性控制病毒对宿主的感染性南昌大学食品院食品微生物组2、病毒的蛋白质病毒蛋白质结构蛋白非结构蛋白病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但并不结合于毒粒中的蛋白质。构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质壳体蛋白；基质蛋白；囊膜蛋白；酶蛋白；南昌大学食品院食品微生物组病毒结构蛋白的主要生理功能：1）构成蛋白质外壳，保护病毒核酸破坏；2）决定病毒感染的特异性；3）决定病毒的抗原性，能刺激机体产生相应的抗体；4）构成毒粒酶，或参与病毒对宿主细胞的入侵（如T4噬菌体的溶菌酶等），或参与病毒复制过程中所需要病毒大分子的合成（如
12、逆转录酶等）；南昌大学食品院食品微生物组3.其他成分：较较复复杂杂病毒中病毒中还还含有含有:n脂脂类类：有些病毒包膜中：有些病毒包膜中含有来源于宿主细胞的脂类化合含有来源于宿主细胞的脂类化合物，其中物，其中50-60%50-60%为为磷脂，余磷脂，余为为胆胆固醇。固醇。n多糖：以糖脂、糖蛋白的形式存在。多糖：以糖脂、糖蛋白的形式存在。n有的病毒有的病毒还还含胺含胺类类（丁二胺，亚精胺等）（丁二胺，亚精胺等）、金属离子等、金属离子等，它们是病毒装配时从环境中获得的不恒定成分它们是病毒装配时从环境中获得的不恒定成分。南昌大学食品院食品微生物组三、毒粒的结构毒粒的结构衣壳粒衣壳粒(Capsomere
13、)衣壳衣壳(Capsid)核酸核酸核壳（核壳（nucleocapsid）包膜包膜(envelope)刺突刺突(spike)由一种或几种多肽链折叠由一种或几种多肽链折叠而成的蛋白质亚单位而成的蛋白质亚单位。病毒的蛋白质壳体和病毒核酸病毒的蛋白质壳体和病毒核酸（核心）构成的复合物，又称核（核心）构成的复合物，又称核衣壳。衣壳。包膜或核衣壳上的突起。包膜或核衣壳上的突起。南昌大学食品院食品微生物组 南昌大学食品院食品微生物组壳体结构类型螺旋对称（helical symmetry）壳体二十面体对称(icosahedral symmetry)壳体复合对称(complex symmetry)结构南昌大学食
14、品院食品微生物组亚基有规律地沿着中心轴（核酸）呈螺旋排列，进而形成高度有序、对称的稳定结构。此形状多为RNA病毒，具螺旋对称的动物病毒多有包膜。1.螺旋对称（helical symmetry）壳体：有包膜的螺旋毒粒裸露的螺旋毒粒；南昌大学食品院食品微生物组2.二十面体对称(icosahedral symmetry)壳体：1)球或近球形球或近球形，没有包膜，直径没有包膜，直径70-8070-80nm。2)高倍高倍电镜电镜下下为为多面体多面体,它它有有12个角，个角，20个面，个面，30条棱。呈条棱。呈5（角）：（角）：3（面）：（面）：2（线）轴对称结构。（线）轴对称结构。3)衣壳由衣壳由252
15、个衣壳粒组成，每个衣壳粒通常是由个衣壳粒组成，每个衣壳粒通常是由5个或个或6个蛋白质亚基个蛋白质亚基聚集形成。有聚集形成。有12个称做五邻体（个称做五邻体（penton）的衣壳粒（分子量各为）的衣壳粒（分子量各为70000Da），位于），位于12个角上。每个五邻体上突出一根末端带有顶球的蛋个角上。每个五邻体上突出一根末端带有顶球的蛋白纤维，称为触须样纤维（也叫刺突）。有白纤维，称为触须样纤维（也叫刺突）。有240个六邻体（个六邻体（hexon）（分）（分子量各为子量各为120000Da）位于均匀分布在）位于均匀分布在20个面上。个面上。南昌大学食品院食品微生物组构成对称结构壳体的第二种方式是蛋
16、白质亚基围绕具立方对称的正多面体的角或边排列，进而形成一个封闭的蛋白质的鞘。南昌大学食品院食品微生物组3.复合对称(complex symmetry)大大肠肠杆菌的杆菌的T4噬菌体是噬菌体是由由椭圆椭圆形的二十面体形的二十面体头头部部和螺旋和螺旋对对称的尾部称的尾部组组合而合而成，是病毒中复合成，是病毒中复合对对称的称的代表。代表。有尾噬菌体（有尾噬菌体（tailed phage），），其壳体由头部和尾部组成。其壳体由头部和尾部组成。包装有病毒核酸的头部通常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。包装有病毒核酸的头部通常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。南昌大学食品院食品微生物组第三节第三节 病毒的复制
17、病毒的复制病毒的特点：严格细胞内寄生物，只能在活细胞内繁殖。病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配（病毒组分装配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式释放到）成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做复制（细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做复制（replication）。）。病毒的复制：南昌大学食品院食品微生物组一、病毒的复制周期复制周期（replicativecircle）或称
18、复制循环：自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程。吸附(absorption)；侵入(penetration)；复制(replication)；装配(assembly)（成熟）；释放(release)；南昌大学食品院食品微生物组烈性噬菌体的繁殖过程烈性噬菌体的繁殖过程南昌大学食品院食品微生物组吸附：吸附：噬菌体和宿主细胞上的特异噬菌体和宿主细胞上的特异性吸附部位进行特异性结合，噬菌体性吸附部位进行特异性结合，噬菌体以尾丝牢固吸附在受体上后，靠刺突以尾丝牢固吸附在受体上后，靠刺突“钉钉”在细胞表面上。在细胞表面上。侵入：侵入：核酸注入细胞的过程。噬菌核酸注入细胞的过
19、程。噬菌体尾部所含酶类物质可使细胞壁产生体尾部所含酶类物质可使细胞壁产生一些小孔，然后尾鞘收缩，尾髓刺入一些小孔，然后尾鞘收缩，尾髓刺入细胞壁，并将核酸注入细胞内，蛋白细胞壁，并将核酸注入细胞内，蛋白质外壳留在细胞外。质外壳留在细胞外。复制复制 ：包括核酸的复制和蛋白质包括核酸的复制和蛋白质合成。噬菌体核酸进入宿主细胞后，合成。噬菌体核酸进入宿主细胞后，会控制宿主细胞的合成系统，然后以会控制宿主细胞的合成系统，然后以噬菌体核酸中的指令合成噬菌体所需噬菌体核酸中的指令合成噬菌体所需的核酸和蛋白质。的核酸和蛋白质。南昌大学食品院食品微生物组装配：装配：主要步骤有：主要步骤有：DNADNA分子的缩合
20、分子的缩合通过衣壳包裹通过衣壳包裹DNADNA而形成头部而形成头部尾丝及尾部的其它部件独立装配完成尾丝及尾部的其它部件独立装配完成头部与尾部头部与尾部相结合相结合最后装上尾丝，至此，一个个成熟的形状、最后装上尾丝，至此，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完成。大小相同的噬菌体装配完成。南昌大学食品院食品微生物组释放：释放：方式：方式：裂解：多以裂解细胞的裂解：多以裂解细胞的方式释放。方式释放。分泌：噬菌体穿出细胞，分泌：噬菌体穿出细胞，细胞并不裂解。细胞并不裂解。通常情况下，一个噬菌体通常情况下，一个噬菌体通过上述五个过程能合成通过上述五个过程能合成100100300300个噬菌体。烈个噬
21、菌体。烈性噬菌体的这种生长繁殖性噬菌体的这种生长繁殖方式也称为一步生长，方式也称为一步生长，南昌大学食品院食品微生物组二、烈性噬菌体与一步生长曲线烈性噬菌体(virulentphage):能在宿主细胞内增殖，产生大量子噬菌体并引起细菌裂解的噬菌体烈性噬菌体的这种生长方式称一步生长。南昌大学食品院食品微生物组一步生长曲线（onestepgrowthcurve）1939年，MaxDelbruck&EmoryEllis：E.coli/bacteriopage1、用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞；2、数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清；3、将上述混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染
22、其它细胞；4、保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价；5、以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线；概念：经过一步生长实验后,得到以培养时间为横坐标,以噬菌斑数为纵坐标绘制成的有潜伏期、裂解期和稳定期的特征性曲线。实验过程:敏感菌10ml+Phage1ml混匀，5min,使之吸附离心或用抗phage血清处理,去除过量phage高倍稀释,吸附phage的菌悬液(避免多次吸附)37培养,定时取样样品中加入氯仿裂解细胞24-48h裂解液加入敏感菌液中适当稀释混合液涂布于琼脂培养基上计数噬菌斑人人为为裂解裂解处处理（每理（每5min）一步生长曲线（onestepgrowt
23、hcurve）噬菌体复制（繁殖）的三个阶段：1、吸附期(adsorptionperiod)；游离的噬菌体吸附到宿主细胞2、潜伏期(latentperiod)；从噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体的最短时期3、裂解期(lysisperiod)；随着菌体不断破裂，新噬菌体数目增加，直到最高值平稳期（plateauphase）南昌大学食品院食品微生物组潜伏期（latent period）：毒粒吸附于细胞到受染细胞释放出子代毒粒所需要的最短时间。噬菌体几分钟，动物病毒与植物病毒以小时或天计算。裂解量（burst size)：每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目。等于潜伏期受染细胞的数目除以稳定期受
24、染细胞所释放的全部子代病毒的数目，噬菌体的裂解量一般为几十到几百，动植物病毒几百到上万个。一步生长曲线的特征性数据南昌大学食品院食品微生物组三、温和噬菌体和溶源性温和噬菌体(temperatephage)或称溶源性噬菌体（lysogenicphage）：侵染细菌后不产生子噬菌体和引起细菌裂解的噬菌体。溶源性溶源性(lysogeny)：温和噬菌体侵染敏感细菌后不裂解它们，而与细菌共存的特性。前噬菌体前噬菌体(prophage)：整合于细菌染色体或以质粒形成存在的温和噬菌体基因组称做原噬菌体。（一）温和噬菌体温和噬菌体的溶源性反应：在原噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌
25、体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂而传递给子代细胞。南昌大学食品院食品微生物组（二）溶源性细菌及其检出溶源性感染对细胞的影响：溶源菌的特性：溶源菌的特性：1.溶源性细菌（溶源性细菌（lysogenic bacteria）细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称做溶源性细菌。(2)裂解：自发裂解(spontaneouslysis)诱发裂解(inductivelysis)；(1)具有遗传的、产生前噬菌体的能力；(3)复愈；(4)免疫性(5)溶源转变(6)局限性转导南昌大学食品院食品微生物组2.溶源性细菌的检出：培养UV辐射（诱导裂解）复制培养（进入裂解周期）离心取上清与敏
26、感菌倒平板菌落周围出现透明圈即为溶源性细菌南昌大学食品院食品微生物组南昌大学食品院食品微生物组一、直接法一、直接法:电子显微镜电子显微镜二、间接法二、间接法 间接法的基础：细胞病变效应间接法的基础：细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)病毒感染单位病毒感染单位(virus infection unit)：是指当病毒和敏感宿主混合：是指当病毒和敏感宿主混合时能产生可检测的效应的最小单位。时能产生可检测的效应的最小单位。是指由于病毒感染出现的宏观、局部或普遍的退化性病变是指由于病毒感染出现的宏观、局部或普遍的退化性病变或异常。或异常。第四节第四节 病毒的检出与定量病毒的检出与定
27、量南昌大学食品院食品微生物组由于病毒感染引起的敏感由于病毒感染引起的敏感细胞层上出现的裂解圈或细胞层上出现的裂解圈或细胞抑制圈。细胞抑制圈。(一一)噬菌斑噬菌斑（plaque）Quantificationofbacterialvirusbyplaqueassay南昌大学食品院食品微生物组(二二)蚀斑和感染病灶蚀斑和感染病灶(focus Of infection)若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑（plaque）或称空斑。南昌大学食品院食品微生物组(三三)坏死斑坏死斑(病斑病斑)(lesion)植物病毒敏感植物叶片产生坏死斑，或称
28、枯斑南昌大学食品院食品微生物组式中：式中：n n 为噬菌体效价；为噬菌体效价；Y Y 为噬菌斑数平板；为噬菌斑数平板；V V 为噬菌体稀释液的体积；为噬菌体稀释液的体积；X 为噬菌体稀释液的稀释度。为噬菌体稀释液的稀释度。(四四)病毒定量中的几个概念病毒定量中的几个概念l.l.噬菌体效价噬菌体效价(titretitre，titer)titer)效价是指每效价是指每mlml试样中所含有的侵染性的噬菌体粒子数，或形成噬试样中所含有的侵染性的噬菌体粒子数，或形成噬菌斑单位菌斑单位(plaque forming unit(plaque forming unit，pfupfu)数。数。公式：公式：n n
29、Y YVXVX2成斑率（平板效率）成斑率（平板效率）(efficiency of plating，EoP)南昌大学食品院食品微生物组 (一一)鉴定病原菌，治疗疾病鉴定病原菌，治疗疾病 (二二)防治害虫防治害虫 (三三)作为分子生物学研究的工具作为分子生物学研究的工具 （四）测定辐射剂量（四）测定辐射剂量一、病毒的应用一、病毒的应用第五节第五节 病毒与实践病毒与实践南昌大学食品院食品微生物组噬菌体污染后的补救措施噬菌体污染后的补救措施二、细菌病毒和发酵工业（噬菌体的防治）二、细菌病毒和发酵工业（噬菌体的防治）1.1.污染现象污染现象2.2.污染原因污染原因3.3.防治措施防治措施杜绝噬菌体的各种来源杜绝噬菌体的各种来源控制活菌体的排放控制活菌体的排放使用抗噬菌体菌株和定期轮换生产用菌使用抗噬菌体菌株和定期轮换生产用菌谢谢！谢谢！