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1、学兔兔标准下载ICS11.220CCSB41团体标准T/CVMA1292023口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体竞争磁微粒CLIA检测方法Competitivemagneticparticlebasedchemiluminescenceimmunoassayfordetectingantibodiesagainst3ABCnon-structuralproteinoffootandmouthdiseasevirus2023-11-15发布2023-11-15实施中国兽医协会发布学兔兔标准下载T/CVMA1292023前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起
2、草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由兰州兽研生物科技有限公司提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州兽研生物科技有限公司、广东省农业科学院动物卫生研究所、四川省动物疫病预防控制中心、浙江省动物疫病预防控制中心、上海市动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：林密、付元芳、包艳芳、何莉、赵灵燕、罗胜军、裴超信、王建、袁红、蒋韬、卢曾军、李涛善、孙燕燕、李昕、杨光、孙铭飞、温肖会、陈斌、鞠厚斌、杨显超、赵洪进、张红丽、冯肖肖。I学兔兔标准下载T/CVMA1292023口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC
3、抗体竞争磁微粒CLIA检测方法1范围本文件规定了口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体竞争磁微粒CLIA检测方法的试剂、仪器设备及耗材、操作步骤、结果判定。本文件适用于定量检测猪、牛、羊等偶蹄动物血清中口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18935口蹄疫诊断技术GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和
4、定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。CLIA:化学发光免疫分析法（ChemiluminescenceImmunoassay）ELISA：酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）5试剂5.125浓缩洗液，按照附录A.1配置。5.2磁微粒工作液（偶联口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的磁性微粒）。5.3酶标抗体（碱性磷酸酶标记的3A蛋白单克隆抗体）。5.4稀释液，按照附录A.2配置。5.5口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体工作校准品：包括工作校准品1、工作校准品2、工作校准品3、工作校准品4、工作校准品5、工作校准品6，抗体含量分别为
5、0U、12.5U、50U、200U、800U、1600U，按照附录B制备。1学兔兔标准下载T/CVMA12920235.6口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体产品校准品：包括产品校准品1、产品校准品2、产品校准品3，抗体含量分别为0U、100U、800U，按照附录C.1制备。5.7口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体质控品：质控品130U，质控品2抗体含量范围应为180U300U，按照附录C.2制备。5.8化学发光底物。6仪器设备及耗材本方法应准备仪器设备及耗材如下：全自动化学发光免疫分析仪：磁微粒酶促化学发光检测设备；电子天平：最大称量：Max=220g；最小称量：Min=10mg；显示分度值：d=
6、0.1mg；离心机：最高转速：16000rpm；可调单道移液器（100L、1mL）；1.5mL尖底离心管；反应杯；试剂船。7技术原理本方法使用磁微粒化学发光免疫分析法，采用竞争原理，将口蹄疫3ABC蛋白作为抗原偶联于3m羧基磁微粒上，并同时加入待检血清和酶标抗体，二者竞争性的与3ABC蛋白上的相应表位结合。最后加入化学发光底物，读取发光值，通过检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体工作校准品建立校准曲线，将待检样本检测结果代入校准曲线计算非结构蛋白3ABC的抗体含量，判定阴阳性结果。8实验前准备8.1样品采集及保存样品采集按照NY/T541进行。无菌注射器静脉采血，不少于2mL，用自然析出法分离
7、血清后，置于无菌血清管中，按照GB19489样品处理的生物安全措施、实验室生物安全通用要求处理样本，若在一周内检测，可置28条件下保存，若超过一周检测，应置于-20以下冷冻保存。血清样本运输时应注意28冷藏。8.2样品处理取8.1中的样品，8000r/min，离心2min，取上清放于1.5mL尖底离心管中，体积应大于300L，待检；若样品中存在沉淀或絮状物等杂质，应离心去除杂质，轻微操作，避免出现泡沫。8.3溶液配制洗涤液：将25浓缩洗液用无离子水或蒸馏水1:25倍稀释，装入洗涤液桶。无离子水或蒸馏水均应符合GB/T6682的要求。8.4仪器准备2学兔兔标准下载T/CVMA1292023阅读全
8、自动化学发光免疫分析仪说明书，放置反应杯，扫码放置底物、系统维护液，开始自检。8.5试剂准备将偶联磁微粒工作液、酶标抗体、稀释液分别装入试剂船上对应试剂瓶中，将磁微粒吹打混匀、试剂船瓶盖换为胶盖；将试剂船装入试剂仓中。9操作步骤9.1校准曲线拟合将口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体工作校准品1工作校准品6放入样本架，按照9.4进行检测标定，按9.5制作校准曲线。校准曲线示例见附录D。9.2校准曲线校准将口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体产品校准品1产品校准品3放入样本架，对校准曲线进行校准。以下情况应校准后再进行检测：a)试剂成分发生改变；b)同一批次试剂盒使用周期超过28d；c)质控结果不符合要
9、求。9.3质控需要时检测质控品，检测值在参考范围内方可继续样品检测。如下情况应检测质控品：a)试剂成分发生改变或校准曲线校准后；b)质控品超过24h需检测1次。9.4样品检测取待检样本于1.5mL/2mL离心管中（样本量需300L以上），置于专用样品架，设置测试样品信息，进行检测。整个检测过程在全自动化学发光免疫分析仪上进行，具体检测过程如下：a)免疫反应：取50L待测样本，15L磁微粒工作液、15L酶标抗体、60L稀释液，分别加入反应杯中，37孵育20min；b)清洗：使用磁铁吸附磁微粒30s，使其聚集于管壁，弃去上清液。加入1洗涤液300mL悬浮磁微粒，混匀30s后吸附磁微粒，弃去1洗涤液
10、。重复清洗3次。c)检测：加入化学发光底物100mL于清洗后的反应杯中，混匀30s悬浮磁微粒，37反应3分钟，检测发光值（RLU）。d)计算：将发光值（RLU）代入校准曲线，计算样本中非结构蛋白3ABC抗体含量。9.5结果计算检测完成后，以工作校准品抗体含量（0U、12.5U、50U、200U、800U、1600U）为横坐标、相应检测发光值为纵坐标拟合四参数为校准曲线，四参数公式为Y=(a-d)/1+(x/c)*b+d，当R2高于0.99时，可以用于结果计算和判定。将待检样品检测发光值代入校准曲线，计算结果即为待检样本中口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体含量。3学兔兔标准下载T/CVMA1292
11、02310结果判定10.1质控血清参考范围质控品1抗体含量30U，质控品2抗体含量在180U300U范围内，实验结果成立。10.2阴阳性判定依据抗体含量180U时，判为口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体阳性；抗体含量180U判为口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体阴性。4名称称量磷酸氢二钠1.15g氯化钠8.00g磷酸二氢钠0.20g牛血清白蛋白1.00g海藻糖5.00g吐温-200.50mL名称称量丁二酸1.98g六水丁二酸钠62.16g氯化钠225.00g吐温-2013.75g名称称量磷酸氢二钠1.15g氯化钠8.00g磷酸二氢钠0.20g吐温-200.50mL兔学兔标准下载T/CVMA1292
12、023附录A（规范性）试剂的配制A.125浓缩洗液配制将表A.1中的试剂依次加入烧杯中，加灭菌蒸馏水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于28保存备用。表A.125浓缩洗液配方A.2稀释液配制将表A.2中的试剂依次加入烧杯中，加灭菌蒸馏水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于28保存备用。表A.2稀释液配方A.3校准品稀释液配制按表A.3中的试剂依次加入烧杯中，加灭菌蒸馏水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于28保存备用。表A.3校准品稀释液配方5学兔兔标准下载T/CVMA1292023附录B（规范性）口蹄疫病毒非结构蛋白抗体工作校准品制备B.1口蹄疫病毒非结构蛋白标准血清
13、制备筛选口蹄疫病毒抗原和抗体为阴性的牛用于感染试验，同时检测病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原和抗体为阴性，所有进入生物安全三级实验室的牛筛查牛结核分枝杆菌为阴性。在生物安全三级动物舍，用O/CHA/99株口蹄疫病毒接种牛，舌皮下注射2mL/头，于25日后出现口蹄疫症状，即蹄冠、蹄叉、蹄踵、鼻端发生水疱，体温升高至4142，拒食跛行，进行性消瘦等特征。无菌分离康复后1个月的动物血清，置于56水浴灭活3040min后，10000r/min离心10min，取上清再用0.22m滤器过滤除菌，剩余部分加入终浓度20%无菌甘油与适量防腐剂后分装，20以下保存备用。抗体水平合格标准：对采集的血清样品，按照GB
14、/T18935中非结构蛋白3ABC阻断ELISA方法进行抗体检测，血清阻断率PI应大于70%，判为非结构蛋白抗体强阳性；按照GB/T18935中液相阻断ELISA方法检测，抗体滴度应不低于1:90，判为合格。B.2口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体工作校准品制备校准品稀释液梯度稀释B.1所制备的高浓度血清，按照GB/T18935中非结构蛋白3ABC阻断ELISA方法进行抗体检测，计算检测结果，定义检测PI为50%时的血清为100U，若此时稀释比例为1:128，则1:256稀释血清为50U。依次类推，最终选择0U（校准品稀释液）、12.5U、50U、200U、800U、1600U分别为工作校准品1
15、、工作校准品2、工作校准品3、工作校准品4、工作校准品5、工作校准品校准品6，稀释的工作校准品20保存备用，36个月内有效。6学兔兔标准下载T/CVMA1292023附录C（规范性）口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体校准品、质控品C.1口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体产品校准品制备取B.1所制备的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC高浓度血清，用校准品稀释液稀释至抗体含量为100U、800U，分别为口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白抗体产品校准品2、工作校准品3，工作校准品稀释液定义为0U，作为工作校准品1，产品校准品20保存备用，36个月内有效。C.2口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体质控品制备取B.1所制备
16、的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC高浓度血清，用校准品稀释液稀释至抗体含量为12.5U和200U，分别为口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体质控品1和质控品2，用口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC管式化学发光免疫分析检测方法检测5次，计算平均值，质控范围为Mean3SD。质控品20保存备用，36个月内有效。7名称范围标定12523969.55U3546596.17U标定21245251.68U2989450.90U标定3637722.68U1942262.46U标定4121241.23U278123.34U标定510564.17U34009.54U标定6925.25U10497.75U学兔兔标准下载T/CVMA1292023附录D（资料性）校准曲线实例参照R，口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体检测校准曲线，标定1标定6分别是工作校准品1工作校准品6的检测结果，校准1校准3分别为产品校准品1产品校准品3的检测结果，值为0.9999R2为0.9998，相关性较好，如图D.1为口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体检测校准曲线的参考图。其中标定1标定6发光值范围如表D.1所示。注：横坐标为校准品抗体浓度，纵坐标为检测发光值。图D.1口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白抗体检测校准曲线表D.1工作校准品标定发光值范围8