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1、Io变性:二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA 序列分析.其装载的样品量大，回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的lbp) 的核甘酸分子即能分离.聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N ,N ,N , W一四甲基乙二胺) 和过硫酸锭的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N , W亚甲双 丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的，不同浓度丙烯酰胺和DNA 的有效分离范围见表2.丙烯酰胺(%)有效分离范围(bp)漠酚兰*二甲苯青
2、*3.5 100 2000 100 4605.0 80-500 65 2608.0 60-400 45 16012.0 40 200 30 7015.0 25-150 15 603 .到胶：长板靠正版（红纽），短板靠负极（黑纽），胶液从长板上面倒入，注意无气泡（PAG有神经毒）缓冲液：lxTBE（5*TBE的配方，稀释即可）Tris 54g总体积硼酸 27.5g 1000mlEDTA 3.72gH2O6% PAG30%PAG 200ml5*TBE 200ml加水定容1000ml4 .加样：样本2.5ul载体buffer （蔗糖，二甲苯清，漠分蓝）2.5ul5 .显色:1 .加乙醇，醋酸固定水洗
3、力AgN03水洗双胺银染NH30H与Ag -双胺聚合非双胺银染碱性条件下，甲醛还原2 .3 10%乙醇lOmin4 HNOB 3min，纯水洗2遍加AgNO3 20min，纯水洗2遍加NaC03（含甲醛）显色,纯水洗水洗冰乙酸终止反应600V , 1 - 2H20.0 10 100 12 45*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).()材料1 .电泳仪器:电泳仪，垂直电泳槽及其附件.2 .准备工作：lo必要时可用KOH/甲醇清洗玻璃板和间隔片2 .用温热的去污剂溶液洗涤玻璃片和间隔片，再充分漂洗，先用自来水，再用去离子 水，应拿取玻璃板的边缘部分或戴手套操作
4、，以免手上的油脂残留再玻璃板的工作面上。 用乙醇冲洗玻璃板，并将其至于一边晾干。3 .安装玻璃与间隔片：将较大的(不带拗口)玻璃板平放在试验台上，在玻璃板的两 侧将间隔片平行至于边缘放妥：用凡士林轻涂以帮组与间隔片在后面操作中保持原位；将 那板在间隔片上放稳。3.30 %丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N , N亚甲基双丙烯酰胺,1克H2O ,加至 100ml装于棕色瓶内，4。（：可保存二个月.3.31 %过硫酸镀过硫酰锭,1克加水至，10ml4可保存一周，-20可保存一个月.4.1XTBE 电泳缓冲液：（89mmol/ITris-硼酸,2mmol/IEDTA（ph8.0）,TBE 用 5x储备 液稀
5、释即可，缓冲液PH8.35.TEMED（四甲基乙烯基二胺）35ul（二）聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶.1 .按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封 闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.2 .将装好的玻璃电泳板倾斜成4560.3 .按表3配制所需浓度凝胶的毫升数.4 .将 上述液体加入TEMED35ul后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直 到液体接近溢出时为止.最后加入lmlH20覆盖层，室温静置30min左右至分离胶凝聚, 倾去覆盖层，并用吸水纸吸净。5 .将上述液体混匀后加入电泳槽中立即插入适当的梳子，
6、密切注意防止梳齿下产生气 泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10 角，可减少液体泄漏的机会.6 .室温聚合lh后（聚合完全后，用IxTBE浸润的纸巾保绕梳子和凝胶的顶部，然后 用saran wrap膜密封整块凝胶，4度保存，直至使用），将玻璃板插入电泳槽中，上紧, 倒入1XTBE缓冲液7 .当准备好电泳时,在梳子周围及顶部喷些IxTBE缓冲液，从聚合的凝胶中小心取出梳子，立即用注射器吸取IxTBE缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子 上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致 以后DNA电泳带型不规则.用剃刀除去凝胶底
7、部的密封条8 .将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后（.制备样品：取中号EP管，每管加入 10ul,4*loading buffer,加样20 - 30ul （视样品浓度而定），混匀后,煮沸5min,离心）,加到样品孔内，加样时不要产生气泡.（加样孔中的气泡要用注射器针头除去）9 .接好电极，电压为l-8V/cm ,进行电泳.电泳80Vxlhr,然后调置100V*4hr10 .根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.11 .电泳毕，切断电源，弃去电泳仪，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸 附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的演化乙锭溶液中,1530min后取出水洗紫外 仪下观察结果
8、.12 .聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出 10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度，可 用银染.银染1 .染色液：溪化乙定溶液(贮存液0.5ug/ml) (TAE配置：EB为10mg/ml ,取 lul,l*10(-3)ml*10mg/ml=10(-2)mg,10(-2)/x=0.5*10(-3)x=20ml),亚甲基蓝贮存 液(0.001%-0.0025%,TAE 酉己置)2 .步骤：1。将凝胶及其附着的玻璃板轻轻的浸泡入需用的染色液，染色液正好将凝 胶没住即可，室温染色30 - 45min3 .以玻璃板为支持物将凝胶从染液中取出，水冲洗后用KIMwipe纸巾蘸去凝胶表面 多余的液体4 .用
9、一张saran warp膜覆盖在凝胶上，用梳子宽的一端或折叠的K纸巾除去S膜上 的气泡，5 .在紫外透光源上放一张S膜，将凝胶倒置，放在透光源上，移去玻璃板，凝胶留在 S膜上2。非变性法医的非变性聚丙烯酰安凝胶电泳1 .基因组提取DNA2 . Chelx-100配方:TE buffer:IM Tris HCL(PH=8.0)Tris base 121.9gGlass-diatilled 800ml(concentrated HCL) 45mL10ml0.5M EDTA 0.2mlGlass -distilled (deconized water) 990ml扩增水IM NAOH 200ul3
10、.步骤：取全血40ul加入1.5ml管中加入TElml室温，15min离心 10000 转，5min弃上清，加入chelex200ul56度水浴，30min冰箱保存唾液拭子：剪下于1.5ml管中，加ddH2O lml,10min,来回吸液冲柱，抽液体离心， 弃上请，加入chelex-100(200ul)和蛋白酶K(3ul),36度水浴30min,沸水8 - lOmin,取出 冰浴5mm，离心备用4 .扩增：D NTP 6 （不变）10*buffer 3.75（不变）Primeri 0.3 （不变）Primer2 0.3 （不变）Taq 酶（5U/ul）:加入 0.3ul,（3U/ul）:力口入 0.5ul 0.5 （可变）（加入量为 1.5U）BSA 3.75 （不变）Mg2+ 2.25 （不变）样本DNA 5 （可变）总体积37.55 .电泳1 ,胶配方：（7%）30%PAG 8.2ml）三者可以一起用（7%的胶），总体积为36mllOxTBE 3.5mlH20 23.3mlTEMED 30ulPA 300ul.胶配方：（6%）30%PAG（双丙稀15G总体积单丙稀285GH20 1000ml7ml）三者可以一起用（6%的胶），总体积为36mllOxTBE 3.5mlH2O 24.5mlTEMED 30ulPA 300ul