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1、反义 RNA 技术原理及在疾病治疗中的作用摘要仮义 RNA 技术是利用反义RNA 能够与特异靶RNA 通过配对碱基间氢键 作用而互补配对，从而在基因复制、转录和翻译 3 个不同水平上参与基因表达的调控,来治疗各种遗传性或病毒感染性疾病的一项技术。本文在争论反义RNA 技术的作用机制和与反义寡核苷酸技术的比较的根底上，拟概述反义RNA 的作用机制、技 术方法与特点、技术运用和存在的问题。信任随着对基因功能争论的广泛开展及基 因治疗争论的深入，反义RNA 技术必将成为一种有力的工具，在疾病治疗中起到重 要的作用。关键词:反义 RNA;基因表达调控;基因治疗反义核酸技术是继基因克隆和重组技术后分子生
2、物学领域兴起的一种全的技 术。该技术由于其核苷酸具有与 DNA 意义链一样的序列且可以选择性地抑制特定基因的表达而得名。广义的反义核酸技术包括：反义寡核苷酸技术antisenseoligo nucleotides,ASOD,即直接应用一段人工合成的寡聚核苷酸，通过碱基配对与细 胞内核酸结合，特异的调整基因表达。反义 RNA 技术antisense RNA 是利用基因重组技术，构建表达载体，使其离体或在体内表达出反义的 RNA。核酶技术 ribozyme 核酶是一种可自我催化的特别的反义 RNA,能与靶序列结合并使之裂解, 从而对特定基因的表达进展调控。反义 RNAa ntise nse RNA
3、 是一种本身缺乏编码能 力,但能与特异靶 RNA主要是mRNA 互补的 RNA 分子，它可通过配对碱基间氢键 作用与靶 RNA 的特定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶RNA 的功能,从而调控基因的正常表达1。反义RNA 技术的根本原理是利用自然存在的或人工合成的反 义RNA,通过基因重组技术反向插入到适宜的表达载体形成重组 DNA,然后转染受体细胞，则这一反向插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA,对基因的表达进行调控，从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。选择具有明显的生物学效应的靶序 列后，反义RNA 即通过和相应的RNA 互补而到达阻断其功能的目的。近 20 多年来,反义 RNA 技术
4、已在病毒病、癌症、遗传性疾病等疑难疾病的基因治疗、动植物品种的改进以及生物争论方法的改进方面取得了令人瞩目的成就。本文在争论反义 RNA 技术的作用机制和与反义寡核苷酸技术的比较的根底上，拟概述反义RNA 的作用机制、技术方法与特点、技术运用和存在的问题。1 反义寡核苷酸技术与反义 RNA 技术1.1 反义寡核苷酸技术1978 年,Zamecnik 首先应用一种 13 个碱基的寡核苷酸抑制 Rous 肉瘤病毒，取得 肯定效果1,此后，随着对其作用机制、特异性及药理作用等争论的深入，其应用范围 不断扩大。由于 ASOD 的易降解性，在试验中通常要对其进展修饰，硫代反义寡核苷 酸作为第一代反义寡核
5、苷酸的代表，由于在细胞毒性、细胞吸取率等方面存在众多问题,Agrawal 等设计了其次代混合骨架的反义寡核苷酸mixed-backboneoligo nucleotides ,MBO,MBO 含有至少两种不同的化学修饰，在构造上可以是任意两 种或多种修饰的不同排列组合。MBO 不仅保持了核酸酶抗性，而且具有很好的靶序 列杂交特异性和相对较低的毒副作用2。近年来以 2-氨基乙基甘氨酸为根本单元的多肽核酸peptide nucleic acid,PNA 由于可与互补的RNA 或DNA 形成稳定的PNA/DNARNA 杂合链并且具有较强的蛋白酶、核酸酶抗性而预示了其作为反义 抑制剂的用途，被称为第三
6、代反义核酸3,但细胞对PNA 的吸取效率较低的问题一 直没有得到很好解决。并且，由于寡核苷酸的半衰期较短，有必要反复应用ASOD 0 事实上，以上三代寡核苷酸较高的制备本钱也是阻碍其广泛应用的因素之一。同时 在反义寡核苷酸的设计上还较盲目，要设计出高效的反义寡核苷酸并非易事。相对 而言，包含反义RNA 的重组质粒则相当于具有生物兼容性和生物降解性的长期释放 装置。2 反义 RNA 作用机制与 ASOD 方法相比，设计反义RNA 时一般不需要目的基因的具体的调控学问, 人们普遍应用由翻译起始位点延长 0.5kb3.0 kb 的片段作为重组质粒的逆向插入 序列。而全长的 cDNA 序列一般认为没有
7、必要，尤其当目的基因较长时。另外，互补 于 3 端非翻译的序列也往往具有很好效果4。在真核生物中，一般认为对应 5 非编码区的 反义 RNA 优于针对编码区的反义 RNA。包含反义核酸的重组质粒在细胞内转录出反义 mRNA,发挥抑制基因表达的作用。目前，具体的作用机制尚不甚清楚，人们推想可能有：反义RNA 的作用机制主要表现在DNA 复制、转录和翻译 3 个水平上。2.1 DNA 复制中的作用反义 RNA 作为DNA 复制的抑制因子，与引物RNA 结合或作用于引物前体而抑制 DNA 复制，从而降低DNA 的复制效率。E.coli 的COIE1 质粒复制的前提是合成适当的 RNA(RNA n，它
8、自动折叠后与DNA 模板结合形成DNA 复制的引物，从复制起始点上游一 445bp 处开头, 以另一 DNA 为模板反向转录的RNA I 正好与RNA n 的 结合，阻挡了正常引物的产生，从而干扰复制的进展。2.2 转录及转录后水平的作用反义 RNA 与mRNA 5 末端互补结合，阻断帽子构造形成；作用于外显子和内含子的连接区，阻碍前 mRNA 剪接;作用于 polyA 形成位点,阻碍mR-NA 的成熟及其向 胞浆转运。在 crp 基因的 ticRNA(transcription inhibitory complementary RNA 负向自 我调控中,ticRNA 与crp mRNA 的
9、5 端结合，形成类似于RNA 聚合酶识别的转录终 止信号的二级构造，以反式作用对转录过程本身进展调控5。2.3 翻译水平的作用反义 RNA 可直接与mRNA 的 SD 序列(含 RBS 或编码区(主要是 AUG 结合,从 空间上直接阻挡核糖体的正常结合或可直接降解靶mRNA。反义 RNA 与 mRNA在 SD 序列配对形成吻触复合体或在互补区段结合形成 RNA- RNA 双链构造,从而调控翻译的进展。在真核生物细胞中有很多RNA 在翻译水平上表现反义RNA 的功能。如鸡胚胎肌浆中存在的富含 U 的小分子 RNA 称为tcR-NA,它们可以与肌球蛋白重链的 RNA 的 polyA 尾杂交而抑制正
10、常的翻译过程。Audrey 等的争论说明FGF- AS RNA 在翻译过程能有效地抑制 FGF- 2 在哺乳动物细胞中的表达。反义 RNA 的重组DNA 中只有启动子及终止子，当转染细胞后，重组DNA 能自 动表达反义RNA,并且重组DNA 自身可以整合到宿主的基因组 DNA 中,或作为 附 加体”长期存在。在原核细胞中，反义RNA 以针对SD 序列效果最好,而在真核细胞 中以 5 端非编码区为标靶最有效。3 反义 RNA 技术方法3.1 反义表达载体的构建一般应用 RT-PCR 技术克隆出局部目的 cDNA,并在两端加上限制性酶切位点倒向插入真核表达载体中，载体一般要含有下游的 polyA
11、尾以保证转录产物的稳 定。为确定插入方向可应用限制性内切酶酶切或直接测序，曹国栋等人曾介绍一种 PCR 鉴定重组体DNA 插入方向及转染的方法7,可有效解决酶切困难或无适当位 点可供选择的问题。F 面是一些常用的真核表达载体：应用较广的是含SV40(simian virus 40、RSV(Rous sarcoma virus 或 CMV (cytomegalovirus 的启动子 /增加子的质粒载体。尤 其 CMV 的早期启动子/增加子元件可有效的应用于各种人及鼠源的肿瘤细胞系。含 EBV(Epstein-Barrvirus 复制起点的载体，可编码核抗原(EBV nuclear antigen
12、,可以以附加体”形式在细胞中复制，避开了整合入染色体基因组所带来的位置效应。在 应用反义 RNA 技术争论原癌基因在细胞生长、分化及凋亡的调控机制时，人们觉察 反义 RNA 对一些原癌基因表达抑制的同时抑制了细胞的生长 ，从而不利于转化子的筛选8。一种解决方法是选择可诱导型的表达载体，使得筛选后在诱导物的诱导作 用下表达出反义 RNA 并发挥反义作用。1982 年,Karin 等构建含金属硫蛋白-n 型(MT- n 启动子的可诱导型载体，在适当诱导条件下(如 Zn2+、Cd2+等才能启动下游 基因的转录9。应用此类载体进展转染已取得良好效果。构建此类载体时要留意 的是诱导物对生物体可能产生的生
13、物学效应，尤其是毒副作用。近年来消灭了一类 高效且诱导剂生物效应较小的双载体系统，如PVgRXR/plND(Invitrogen,pTet/pTRE(Cl on tech,其原理是第一种质粒能够表达能与诱导剂结合的蛋白，细胞在稳定转染了 第一种质粒后，再转染其次种含目的基因片段或反义片段的质粒，而其次种质粒的表达受控于能被第一种质粒所表达的蛋白所激活的转录启动子。pTet/pTRE 载体系统已成功地应用于细胞培育及转基因小鼠对于某些细胞系，四环素结合蛋白的高表达对其有肯定的毒副作用。3.2 基因的导入转染10。但磷酸钙法、电转法、基因枪是体外试验中 DNA 转染真核细胞的常用方法。脂质体不仅常
14、用于体外试验中载体 DNA 对细胞系的转染，也用于体内试验中的转染过程。脂质体能提高分裂细胞和非分裂细胞对核酸的摄取，并保护其不被降解。优点是操作简洁，细胞吸取较好。缺点是包埋的 DNA 量不确定，体内试验中觉察在特定组织如肝脏吸取的倾向性，及对某些组织如脑有肯定毒性。在此根底上人们渐渐开 发出具有肯定良好特性的转染试剂如 pH-敏-脂质体。各类受体介导的转染试剂往 往使转染更接近自然的生理过程如基于转铁蛋白受体介导的核酸转染试剂，不仅可 能降低毒副作用还可因受体的特异分布而具有转染的组织或细胞特异性。另一种转 化策略是以病毒作为载体， 同时利用了病毒的转染特性。rAAV-ASAAV, ade
15、no- associated virus 腺病毒关心性病毒以其安全、高效而广泛应用于反义 RNA 技术及 基因治疗。它几乎可以转染全部哺乳动物，但对其他动物，如家禽，目前尚未建立起其AAV 系;并且，由于它的转染是细胞膜上受体介导的，哺乳动物的AAV 不能用于家禽 的转染11。逆转录病毒在快速分裂的细胞中转染效率也相当高 ，这使它常被作为载 体应用于肿瘤的治疗中，它可应用于哺乳动物及禽类。其缺乏是它只在快速分裂的 细胞中起作用， 这使它的应用范围受到肯定限制11。一般认为体内的转染需要借助 基因的导入系统gene deliver system,Wolff 和 Malone 等人于 1990 年
16、用表达 3-gal 及荧光酶基因的质粒分别对小鼠肌肉进展直接体内注射该基因的表达12。直接注射法仅对骨骼肌细胞有效等报道基因。，在注射区域的肌细胞检测到，人们推想可能与骨骼肌的多胞核、存在胞环流等构造特性有关。为检验转染效率，人们往往选用旳al 或 pEGFP3.3 检验、结果分析在以反义 RNA 表达载体进展细胞系的转染或体内试验时，应设置空载体转染的 比照试验，以排解外源载体DNA 的导入带来的生物学或免疫学效应。体外试验中基 因产物的活性、细胞的增殖、分化等生物学参数 ，体内试验中动物本身的一些生物学表型的转变均是不行无视的重要指标。在此根底上分子生物学水平的分析主要有 以下几个方面：除
17、了以正义探针检验反义RNA 的表达状况外，我们更关心的是靶基 因的表达情况。应用进展中的核转录分析 nu clear run on tran scri pti on assay 能够较牢靠的测定基因转录活性。对 mRNA 水平的检验方法除了 Northern 印迹,RNA 保护试验RNase protection assays 敏度更高，并且可以进展较准确的定量分析。由于目前反义 RNA 抑制靶基因表达的原理尚在争论之中，而反义RNA 抑制靶基因表达的 过程中并不肯定伴随着 mRNA 水平的降低13,所以检测反义抑制效果的较为客观的标准是相应蛋白水平的变化。 Western 印迹,ELISA,
18、流式细胞分析法flow cytometry 均是常用的分析技术。免疫组化技术、免疫荧光技术由于不能很好的定 量而一般避开使用。4 反义 RNA 技术的特点4.1 特异性强反义 RNA 在宿主细胞内可以特异性地识别、关闭某一基因，阻断靶基因的表达，甚至可以选择性地抑制单一启动子掌握的多基因区内某一基因的表达它基因的表达14。4.2 操作简便，靶 mRNA 范围广，而不影响其可以大量地设计合成反义 RNA或反义RNA 片段，仅需要知道病毒、基因或病变细胞的序列信息及其编码蛋白的功能。多个反义 RNA 可同时封闭多个基因，在核内和胞浆中都能发扌车作用，用于治疗多种疾病。4.3 安全性好反义 RNA
19、只与特定的mRNA 结合，不会因转变基因构造而引起突变，在剂量多 的状况F 可以被 RNase 水解。与合成药物相比，副作用较小。而且将含有反义 RNA 基因的载体引入原代细胞，可形成持续稳定的感染细胞系，使后代具有遗传的抗病毒或 抗病特性。5 反义 RNA 技术的应用反义 RNA 技术已可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病和严峻感染性 疾病。5.1 抗癌作用从癌组织中分别出 mRNA,合成相应的反义RNA。将反义 RNA 引入癌细胞阻 止癌基因的表达，抑制癌蛋白的产生，从而可掌握细胞的恶性增殖。桑建利等15利 用构建了的细胞周期蛋白 E 反义RNA 真核载体转入人乳腺癌细胞时，也觉察癌细
20、胞 成集落力量显著下降。Ste iner 等16在反转录病毒载体上构建了包括起始位点在内的 750bp 的反义RNA,经PA317 包装成反转录病毒皮下注入，觉察能抑制裸鼠DN145 移植瘤生长 94.5%,其中 2 只小鼠肿瘤消逝。Keiichiro 等17承受反义RNA阻断龋齿类动物和人类肿瘤细胞的表型构造形成中，把载有反义RNA 的质粒转染入 人的乳头状瘤病毒HPV 阴性 C33 细胞、HPV- 16 阳性SiHa 细胞和HPV- 18 阳性HeLa 细胞S3 中进展反转克隆。觉察反义的克隆形成的集落数明显少于野生型克隆的集落数。此结果说明用反义 RNA 能够很强地阻断裸鼠中致癌性细胞。
21、Volker 等 18的争论结果同样也证明白反义 RNA 能够有效阻断 HeLa 细胞中的基因表达。另 有争论说明反义RNA 可以通过阻挡组织蛋白酶-L 的表达进而降低恶性的肿瘤发生 力量19。综上可见，反义 RNA 可以特异性地抑制癌基因的特别表达或抑制肿瘤癌 细胞特异蛋白质的表达，诱导肿瘤癌细胞调亡，因而可应用于癌症的发病机制和治疗 争论。5.2 抗病毒的争论在治疗病毒性感染疾病上，由于病毒核酸的序列比较明确，易于人工合成相应的 反义寡聚核苷酸，来抑制病毒基因的表达。反义 RNA 技术已用于抑制乙肝病毒HBV、疱疹病毒HIV、AIDS 病毒等病毒的争论。Morgan 等1996 的争论说明
22、HIV 的反式激活蛋白反响挨次TAR 与 TAT 蛋白结合可促进HIV 转录，当用反义TAR 封闭TAR 时,即可终止 HIV的转录。姚志强等20针对不同靶位设计了 10 段互补反义核酸DNA 片段，经 模型筛选觉察针对 S 基因起始区、SP2 增加子帽区和polyA 信号编码区的asONs 作 用最强，提醒反调整基因转录/翻译起始区的反义核酸具有明显的抗病毒作用。Gabor 等1998 使用内源性表达抗 HIV- 1 的 pol.vif 和enr 基因，以及 3-LTR 序列的反义 RNA 方案,构建了 MuLVLTR 启动子逆转录病毒重组质粒，转录CD4+淋巴细胞 系,结果说明反义 RNA
23、 能高效地稳定表达，反义 envRNA 能够最有效地抑制HIV- 1 的复制，并且反义polRNA使 P24 抗原削减了 100- 1000 倍。Carol 等21的争论说明, 反义 RNA 能有效地阻断La Crosse病毒LCV,并且来自dengne Viruses 区的反义RNA 更能有效阻挡同源病毒的复制,且阻断时间和最小片段的反义 RNA 都能确定, 它可以弥补接种等传统方法存在的不易到达阻挡效果和效率较低的缺点。反义RNA 还用于争论甲型流感病毒AIV 及乳头瘤病毒HPV17复制及基因表达的抑 制。另外， 国内外在应用反义 RNA 技术培育抗病如猪瘟、抗鸡马立克氏病等动物 品系方面
24、也取得比较明显的进展。5.3 在其它方面的争论反义 RNA 技术还可用于肠道疾病Rotbart etal.,198&心血管疾病22、伕地中海贫血23、调整衰弱心脏中肌细胞的 Ca2+泵体内平衡24、G 蛋白防止高血压、 肝纤维化等多种疾病的争论25。 Don-ald 等26的争论觉察恶性疟原虫的clag9 基 因对CD36 细胞的粘链是必不行少的，而将 clag9 的反义RNA 构造导入 3D7 克隆中 进展培育，觉察粘链的 C32 黑素瘤细胞比原始型少 15 折叠，由此反义RNA 也可用于 疟疾的转染治疗。Agnes 等27在对高加索人中的一种常染色体隐性疾病遗传性血 色素冷静争论中觉察，它
25、是由HFE 基因编码MHC 分子而造成的，HFE 基因的 5”端调 节其表达,承受无开放阅读框的 HFE 的反义 RNA 导入细胞内，觉察反义RNA 在全部 试验的组织和细胞中都得到表达，显著地抑制了HFE 基因的表达。6 反义 RNA 技术应用中的问题反义 RNA 技术的争论尚处于初级阶段，但迄今的争论结果说明，该技术作为具 有咼度专一性的基因表达的反义抑制剂是很有期望的。在根底争论方面，反义 RNA 技术不仅用于基因分析，还可用来制备C-缩短的多肽，以争论蛋白质构造活性关系而无须使基因变异；争论细胞信号传导、细胞分化及癌变的发生、进展过程等等。在 应用争论方面，反义RNA 药物可以特异性的
26、抑制癌基因的特别表达或抑制肿瘤细胞 特异蛋白质的表达，诱导肿瘤细胞凋亡；在抗病原微生物感染方面，针对其特异基因的 反义核酸可较好的阻挡其对人体的侵害，反义核酸技术用于抗癌、抗病毒的基因疗 法方面已有大量报道， 包括对 HIV、HSV 等的防治。其他方面，如防治高血压、肝纤维化等多种疾病。人们正在开掘更广泛的应用领域。但反义RNA 技术也存在一些冋题，下面就是主要的冋题。6.1 反义RNA 片段的特异性问题多少长度的反义 RNA 片段才能最有效地结合靶 mRNA;对于不同种属、不同的组织和器官的病变细胞，分别需要设计多少长度的高效反义 RNA 片段;对应的是 5”端还是 3 端;是编码区还是非编
27、码区等问题都需进一步争论，以到达特异性的抑制效 果。动物体某一器官、组织或系统中细胞发生病变往往是个体特定基因的失控或有 害基因表达造成的，在基因治疗时，必需针对病变的特别细胞，而对其它细胞影响较小 为佳，甚至无影响。因此反义 RNA 的基因治疗必需特异性、专一性地转移到病变细 胞抑制其表达，只有这样才能最有效地发挥作用。6.2 制备反义RNA 的费用和使用效率的问题应用 QB 复制酶、体外转录等技术合成反义 RNA,耗资较大。随着科技的进展,准确地合成所需反义 RNA 的技术肯定能得到完善和提高。目前，已经在体外合成反 义 RNA,直接作用于培育细胞，反义 RNA 在细胞中转录而发挥作用。还
28、有就是构建 一些转录特异反义 RNA 的重组 DNA,将这些重组DNA 转化细胞，让其在细胞中转录反义 RNA 而发挥作用。但反义RNA 的碱基序列、反义RNA 中无效的长度、含 量、靶序列结合部位和反义 RNA 的浓度等也都影响到使用效率。而且反义 RNA和靶 mRNA 的发卡、内部环等二级或三级构造以及简单的环环构造都影响反义抑 制效率28- 30。7 结语经过近 20 年的争论，反义RNA 技术已得到逐步完善并开头应用到医疗实践 中。目前对反义 RNA 的转染效率、特异性及治疗时反义 RNA 的用量、持续时间和进入机体的有效途径等都进展了量的争论。承受反义RNA 表达载体和受体介导能进一
29、步提高反义 RNA 的特异性;脂质体和含有核酶的嵌合性运送反义 RNA;核内 反义 RNA 作为治疗因子避开了在细胞浆需抑制极其巨大数量的靶 RNA 则提高了抑制率，削减了反义RNA 用量,扩宽了抑制治疗范围；在体内可诱导性调控序列的嵌 入则更加提高了反义 RNA 技术的应用。在人类基因组打算完成，后基因组打算已渐 进开展的根底上，反义RNA 技术将不断改进和进展，并将在基因的鉴定克隆和各种 疾病的治疗上发挥重大的作用。参考文献:1 Sim ons R W. Naturally occurri ng an tise nse con trol- A brief reviewJ. Gene, 19
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