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1、仅仅争论于生命科学，不适合在诊断过程使用12只能在体外使用地高辛DNA 标记和检测试剂盒 1和 NBT/BCIP 一起用于颜色检测通过酶联免疫法承受地高辛-dUTP 进展随机引物DNA 标记，碱性标记和检测货号：11 745 832 910此试剂盒储存条件-15oC-25oC此试剂盒可对 10ng-3ugDNA 进展 12 次标记反响可检测 100cm2 面积的杂交膜 24 张指导手册2023.11 版1 前言1.1 内容表1 前言21.1 内容表21.2 试剂盒内容32 简介52.1 产品概述53 步骤和所需材料83.1 开头之前83.2 地高辛DNA 标记93.3 标记效率的测定113.4
2、 DNA 的转移和固定143.5 杂交163.6 免疫检测183.7 DNA 印记的洗脱和再杂交204 结果214.1 典型的结果215 附录235.1 故障排解235.2 引用245.3 订购信息251.2试剂盒内容瓶/杯号 标签1 地高辛高效引物2 DIG标记的比照DNA3 DNA 稀释缓冲液4 抗地高辛的碱性磷酸酶结合物5 NBT/BCIP6 封闭液7 地高辛杂交颗粒内容 包括功能1. 50ul 地高辛高效引物2. 5标记的混合物的浓度，包括随机引物，核苷酸，DIG-dUTP(碱标记的)，Klenow 酶和缓冲液混合的最正确浓度。3. 随时可用4. 澄清的粘液5. 用于DNA 的高效随机
3、引物标记20ul5ug/ml PBR328 DNA用Bam HI 线性化 澄清溶液用于确定标记效率31ml50ug/ml 鱼精DNA 在 10mM Tris-HC 中，1mMEDTA ;在 25oCpH8.0 澄清溶液100ul750U/ml从羊，Fab 段，结合碱性磷酸酶中猎取的澄清溶液61ml50浓度的原溶液即 67%v/v的 DMSO 中含有 18.75mg/ml硝基氯化四氮唑蓝和 9.4mg/ml 5 -溴- 4 -氯-3-吲哚磷酸盐 可以在浅黄色和棕色之间变化，澄清溶液与碱性磷酸酶反响4100ml10浓度 黄色，粘液预备 4100ml为 17 页做预备 杂交液附加仪器与所需试剂除了上
4、表中列出的试剂外，你必需预备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要预备的设备概要。在每个操作程序的前面供给了具体的信息操作程序3.2 DIG-DNA 标记3.3 标记效率的半定量测定仪器设备水浴带正电荷的尼龙膜*试剂灭菌的双蒸水0.2M pH8.0 灭菌的EDTA地高辛洗涤和封组缓冲液组合*TE 缓冲液或者洗涤缓冲液 马来酸缓冲液检测缓冲液TE 缓冲液3.4 DNA 转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备20ssc或者 10ssc3.5 杂交3.6 免疫检测3.8 DNA 斑点的脱色和重标记探针尼龙膜，带正电荷* 杂交袋*或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶留意：当用地高辛杂交缓冲
5、液工作时，不要用开口的托盘容器大小与滤器大小相适应杂交袋*大的托盘水浴地高辛洗涤和封组缓冲液组合*TE 缓冲液或者洗涤缓冲液 马来酸缓冲液检测缓冲液TE 缓冲液10ssc 10%SDS0.2M NaOH*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得2 介绍2.1 产品概况试验原则此试剂盒承受地高辛DIG，一种甾类半抗原， 去标记DNA 探针从而通过酶免疫分析法用于杂交和后续的颜色检测1步骤DNA 标记杂交免疫检测描述依据随机引物标记技术承受地高辛标记的高效引物获得了地高辛标记 的 DNA 探针。地高辛标记的高效引物是一种特地生产的产物混合物， 其中，含有地高辛dUTP，碱性
6、标记图 2和全部的试剂，包括随机引物标记所必需的酶，已预先优化的5浓度反响缓冲液依据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采 用碱标记形式的地高辛-11-dUTP 能够更加简洁和有效的被洗脱下来， 使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交杂交探针可以和抗地高辛的碱性磷酸酶结合物和Fab 段进展免疫检测， 然后承受比色底物NBT/BCIP 可以看到杂交结果。应用地高辛标记DNA 探针可以用于： 全部类型的滤膜杂交总基因组DNA 中单拷贝基因的检测，甚至对于高度简单的生物也可以进展检测，如人，大麦和小麦。样品材料至少 100bp 的 DNA 片段线性的质粒，cos 质粒
7、或者DNA 超螺旋的DNA试验时间此表格列出了每一步试验所需的反响时间步骤DNA 标记杂交免疫检测显色反响时间1 小时-O/N6 小时或者O/N1.5 小时0.5-16 小时检测数量一个试剂盒足够用于：不超过 3ug 的模板DNA 的 12 个标准的标记反响和 100cm2有 24 个斑点的检测质量掌握依据操作步骤中的描述，对未标记的比照品 DNAPBR328进展标记，0.1pg 同源DNA 在点杂交中通过 16h 的显色来检测1pg 同源DNA 可以通过 1 小时的显色进展检测。试剂盒的储存和稳定性未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15oC 到-25oC保质期印在标签上。在干冰中运输
8、一旦开封，请依据下表达选择适宜的储存条件。试剂盒成分抗地高辛碱性磷酸酶结合物4 号管cap 2-8oC储存条件稳定封组液6 号管bottle未开封时 15oC-25oC 稳定一旦开封，应分装并储存在-15oC 到-25oC 或者无菌条件下 2-8oC 间可以保存 1 个月。 工作溶液都应是颖配制的NBT/BCIP(6 号管cap)2-8oC，稳定或者在 15-25oC，至少 4 周留意：在干冰中运输过程中，温度快速升到37oC 时，物质简洁溶解从而导致沉淀产生灵敏度和特异性承受 southern 杂交从 1ug 消化胎盘DNA 中检测到单拷贝人基因留意：灵敏度同时依据在杂交中标记的DNA 浓度
9、和颜色反响的时间优点此表描述了这个试剂盒的优点和特征优点特征准确，快速预先已混好的地高辛高效引物混合物削减了标记DNA 时手动操作的时间，同时提高了产量，重复性好灵敏在简单的整个的人 DNA 及植物基因组中能够检测到单拷贝基因省时地高辛标记的探针可以至少储存一年。杂交溶液可以重复利用 3-5 次，重复次数主要取决于每次杂交中产生信号的标记探针的量3 试验步骤和所需材料3.1 在你开头前主要的操作要求此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示要求在清洁的条件下进展操作用干净的孵育托盘处理膜的要求流程图指引 高效灭菌地高辛系统的试剂过滤灭菌的溶液包括：SDS，吐温 20，并应当参加到已灭菌的溶液中每
10、次使用前都要严格地清洗试验托盘带无粉手套处理膜的时候，只能用干净的镊子夹膜的边缘3.2 局部地高辛标记 DNA3.3 局部标记效率的检测3.4 局部DNA 固定3.5 局部杂交3.6 局部免疫检测3.7 局部DNA 斑点的洗脱与重标记探针3.2 地高辛标记 DNA介绍随机引物标记的DNA 带有地高辛-11-dUTP，这一标记承受的是地高辛高效引物试剂， 这是一种含有随机六碳糖，5 乘浓度标记的混合物，其中，dNTP 混合物包括碱性标记的地高辛-11-dUTP，标记级的 Klenow 酶和适合的反响缓冲液。附加设备和所需试剂水浴冰水混合物此表中列出了成分你，储存条件和除了试剂盒成格外所需试剂的用
11、途溶液水EDTA成分高压灭菌的双蒸水0.2M EDTAPH8.0储存条件/稳定性15-25 OC，稳定15-25 OC，稳定用途稀释DNA终止标记反响模板 DNA特征具体信息质粒DNA 承受高纯质粒提取试剂盒进展净化。纯度当承受其他商业化的纯化试剂盒进展纯化时，我们建议额外进展一次苯酚/氯仿抽提以去除剩余的蛋白质。在标记之前假设对模板进展限制酶切或者其他酶的修饰作用，那么此步骤也是需要进展的。大小为了获得抱负的结果，模板DNA 应当线性化，且大小应当在100 或者以上。假设模板DNA 大于 5kb，那么在标记之前应当承受限制性酶切序列为 4 个核苷酸的限制性酶如Hae 对模板进展酶解数量依据上
12、面步骤的描述，原则上 10ng-3g的模板均可以标记上，然而请认真查看在给定的表中，用于你的杂交试验所需的探针的数量。可以依据供给的操作方法放大总体积和成分用量来获得更大量的标记探 针。假设要检测简单基因组中的单拷贝基因，需标记的模板DNA 用量至少 300ng探针浓度：25ng/mL 杂交液。下表中列出了模板DNA 所需特征：标记从琼脂糖凝胶上分别的DNA假设你想要完成基因组的 southern 杂交，你应当利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板 DNA 从载体上分别出来。从凝胶中分别DNA 片段，为获得更好的结果，可以用高效的 PCR 产物纯化试剂盒或者用琼脂糖凝胶DNA 提取试剂盒来从凝胶中
13、分别DNA。步骤此步骤用于标记 10ng-3g DNA 。可以通过扩大全部成分和体积标记更大量的DNA最高达 10g。步骤1操作向一个反响管中参加 1g 模板 DNA线性或超螺旋和高压灭菌的双蒸水，终体积达 16l。234沸水浴 10 分钟以变性DNA，然后快速插入冰水混合物中留意：完全变性对于标记的有效性是格外重要的完全混合地高辛高效引物瓶 1，参加 4l 到变性的DNA 中，混合并短暂离心37孵育 1 小时或者过夜留意：较长的孵育时间最高达 20 小时能够提高地高辛标记DNA 的产量参加 2L 0.2M EDTA(pH8.0) 和/或 65加热 10 分钟终止反响留意：承受地高辛高效引物获
14、得的地高辛标记片段的长度范围可以从200bp 到1000bp甚至更长，这主要取决于原始模板的长度标记反响的产量表 1：此表向您展现了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。在标准反响中每个试验承受 1g DNA 作为模板。1 小时内，大约有 15%的核苷酸参与到了 0.8g 合成的地高辛标记DNA 中。20 小时后消耗了大约 38%约 2g 的核苷酸。模板DNA1h20h10 ng45 ng600ng30 ng130 ng1050 ng100 ng270 ng1500ng300 ng450 ng2023ng1000 ng850 ng2300ng3000 ng1350 ng2650ng使用地高辛高
15、效引物溶液，增加不同模板DNA 的量进展反响，并检测反响1 小时和反响 20 小时的差异。地高辛标记 DNA 的产量由放射线示踪器进展测定，并通过斑点杂交进展证明 10 个独立标记试验的平均值。3.4 标记效率确实定介绍地高辛标记DNA 产量确实定对于获得最正确的，具有可重现性的杂交结果格外重要。在杂交混合物中探针浓度过高简洁产生背景，而太低浓度则简洁导致信号弱。试验原则检测标记探针质量的好方法是直接检测法。步骤1描述将地高辛标记 DNA 的一系列稀释梯度点到一小块带正电荷的尼龙膜上；尼龙膜局部区域已经点好一系列稀释梯度的地高辛标记的比照Vial 2作为标准。DNA承受anti-DIG-AP
16、结合物(Vial 4)和随时即用的NBT/BCIP(Vial 5)对尼龙2膜进展免疫检测。比较地高辛标记DNA 与比照DNA 的一系列稀释点的强度。所需附加溶液的制备请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液，DNA 酶和RNA 酶系列产品中获得。请留意：这些溶液也用于 3.6 中的检测步骤，可大批量预备溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1M 马来酸0.15M NaCl pH 7.5(20)0.3% (v/v)Tween 2015-25,稳定去除未结合的抗体马来酸缓冲液0.1M 马来酸0.15M NaCl用 NaOH(固体)调整pH 值到 7.5
17、(20)15-25,稳定封阻液的稀释检测缓冲液0.1M Tris-HCl 0.1M NaClpH 9.5(20)15-25,稳定调整 pH 值到 9.5TE 缓冲液10mM Tris-HCl 1 mM EDTApH 8.015-25,稳定终止颜色反响管DNA(L)来自于管#DNA 稀释缓冲液稀释比例终浓度试剂盒工作溶液的制备下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：溶液成分/制备方法储存/稳定性用途封阻溶液用马来酸缓冲液依据 1：10 的比例将10封阻液vial 6稀释成 1工作溶液现配现用封阻膜上非特异结合位点每 次 使 用 前 将 原 始 管 中 的anti-digoxigenin-AP(4 号
18、管)10000rpm抗体溶液离心 5 分钟。然后从外表留神吸取所需用量。用封阻溶液依据 150mU/mL 的 比anti-digoxigenin-AP1 ： 5000例 稀 释2-8，12h与地高辛标记的探针结合取 40L NBT/BCIP(5 号管)底物显色液于 2ml 检测缓冲液中混匀现配现用抗体结合的可视化留意：避光保存稀释系列依据合成核苷酸的预期产量开头下面的的系列稀释，标记的探针和地高辛标记的比照DNAVial 2应当稀释到 1ng/L。利用第 3.2 章中图表 1 可以最好的估量出在你的探针中地高辛标记DNA 的预期产量。产量取决于起始时的模板量和孵育时间。留意：表 1 中给出的产
19、量是承受高纯度的DNA 模板在最正确条件下生产出的。依据下表中的描述对你标记的探针和你的比照DNA 进展一系列的梯度稀释。3 号管(L)1稀释的原液1ng/L2514951：10010pg/L3152351：3.33pg/L452451：101pg/L553451：100.3 pg/L654451：100.1 pg/L755451：100.03 pg/L856451：100.01 pg/L90-50-0操作步骤下面的步骤描述的是直接检测。留意：在全部的步骤中，用足够的缓冲液体积完全掩盖膜。步骤操作1分别从你标记的探针和标记比照DNA 的 2-9 号管中取出 1 L点在尼龙膜上2通过紫外交联或者
20、 120烘烤 30 分钟的方法将核酸固定在膜上将膜转移到一个装有 20mL 马来酸缓冲液的塑料容器中3在 15-25中振荡孵育 2 分钟4在 10mL 封阻液中孵育 30 分钟5在 10mL 抗体溶液中孵育 30 分钟6用 10mL 洗涤缓冲液洗涤两次，每次 15 分钟7在 10mL 检测缓冲液中平衡 2-5 分钟8将孵育膜放入盛有预备好的 2ml 底物显色液的盒子中，避光。在显色过程中不能摇动。留意：几分钟后沉淀颜色开头形成，短时间内可适当翻开盒子观看染色状况9当得到预期的斑点或者聚焦强度已经完成，则停顿反响，用无菌双蒸水 50ml或者TE 缓冲液洗膜 5min结果可以用影印湿过滤器或者摄影
21、记录结果分析比较比照与你的标记反响产生的点的强度差异，并计算出地高辛标记DNA 的量。假设你的探针稀释后量达 0.1pg 的点与比照 DNA 的点均可见，那么说明标记的探针到达了预期的标记效率，能够满足杂交所需的探针浓度。孵育时间现象5-10 分钟30pg 斑点30 分钟3pg 斑点3.4 DNA 的转移和固定转移方法和膜凝胶电泳的标准操作方法，胶的变性和中和均参照参考文献中Sambrook 等的文章。胶中不参加EB 会更好，由于EB 可能引起背景不均匀的问题。全部一般类型的DNA 转移方法都适用于后续的地高辛杂交试验4,5；在试验中，在 20SSC 中承受毛细管转移的方法将DNA 转移到带有
22、正电荷的尼龙膜上可以获得最好的结果。留意：碱性转移如在 0.4M NaOH 中不适用于地高辛分子量的标记的转移。固定操作将 DNA 固定到膜上可以通过下面的任何一种操作：假设你想承受那么将膜放到已经用 10SSC 浸透的Whatman 3MM 滤纸上。紫外交联的方法洗涤之前用紫外交联这块潮湿的膜尼龙膜紫外交联后，将膜放入双蒸水中简洁冲洗一下，然后自然晾干。在 2SSC 中洗涤一下膜120，烘烤尼龙膜将尼龙膜放在 120下烘烤 30 分钟或者依据操作说明的要求进展操作。在 2SSC 中洗涤一下膜80，烘烤尼龙膜将尼龙膜放在 80下真空烘烤 2 小时膜的储存请依据下表选择膜的储存方法。假设那么你想
23、连续试验马上将这个膜进展预杂交假设你想稍后进展试验那么将枯燥的膜储存于 2-83.5 杂交需要的附加设备冰水浴 震荡水浴或杂交炉耐高温的塑料或者玻璃盒，培育皿，滚筒瓶或者可密封的塑料袋留意：不要用敞口的容器盛放地高辛杂交缓冲液杂交工作溶液的制备分两次留神的将 64ml 无菌双蒸水参加地高辛杂交颗粒7 号瓶中，然后，马上在 37oC条件下搅拌 5 分钟进展溶解。杂交温度适宜的杂交温度是依据GC 含量和探针与靶片段的相像百分数计算获得的，具体的公式如下：Tm =49.82+0.41(%G+C)-(600/I)I=能够杂交上的片段的长度，以碱基对进展计算Topt.= Tm -2025这一给出数字的方
24、程式是依据杂交溶液中含有50%甲酰胺的标准方程式计算得到的。用于地高辛杂交液进展杂交的实际杂交温度Topt. 要比计算出的Tm 低 20-25。Topt. 可以作为一个严谨的杂交温度，允许探针和靶序列之间有 18%的错配。当你的探针与靶序列的相像度低于 80%时，你应当相应的降低Topt大约每 1%的错配要降低 1.4，同时相应的调整严谨洗涤步骤即提高SSC 浓度和降低洗涤温度。操作步骤请参照下表进展试验。步骤操作1将适量体积的杂交缓冲液DIG EASY Hyb提前预热到杂交温度37-42。在适当的容器中温顺振荡 30 分钟进展预杂交。留意：膜应当自由的移动。尤其是假设你在同一个预杂交溶液中放
25、入几张膜。2变性地高辛标记的DNA 探针：在地高辛杂交液中浓度大约为25ng/mL将探针放入沸水浴中煮 5 分钟后快速放入冰水混合物中冷却。留意：由于 DIG-11-dUTP 是碱标记的，因此 DNA 探针不能用碱处理NaOH 的方法变性。3将变性的地高辛标记探针参加到预热的地高辛杂交缓冲液每 100cm2 的膜加入 3.5mL 杂交缓冲液中，充分混合但要避开产生泡沫气泡简洁产生背景4倒出预杂交液，向膜上参加探针杂交液的混合物；温顺振荡孵育 4 小时或延长孵育至过夜杂交液的储存含有地高辛标记探针的地高辛杂交液可以储存在-15 到-25，可以反复使用几次，在每次使用前需要 68颖变性 10 分钟
26、。留意：不行以将杂交液煮沸。严谨洗涤对于大局部 DNA:DNA 应用,用 0.5SSC 进展严谨洗涤已经足够。针对每个探针来说， 正确的洗涤条件应当依据阅历来确定。对于人基因组DNA，承受的条件是 0.5SSC，65。探针长度大于 150bp 且GC 含量高时，应在 68下进展洗涤。对于长度为 100bp 或更短的探针，洗涤温度应当降低。此表描述了怎样完成后面的杂交洗涤。步骤操作12在 15-25，用足够的 2SSC，0.1%SDS 连续振荡洗涤 2-5 分钟。在 65-68，用足够的0.5SSC，0.1%SDS提前预热到洗涤温度连续振荡洗涤 2-15 分钟。3.6 免疫检测 需要附加的试剂请
27、找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液，DNA 酶和RNA 酶系列产品中获得。溶液成分/制备储存/稳定性用途洗涤缓冲液0.1M 马来酸0.15M NaCl pH 7.5(20)0.3% (v/v)Tween 2015-25,稳定去除未结合的抗体膜的洗涤马来酸缓冲液0.1M 马来酸0.15M NaCl用 NaOH(固体)调整pH 值到 7.5(20)15-25,稳定封阻液的稀释检测缓冲液0.1M Tris-HCl 0.1M NaClpH 9.5(20)15-25,稳定调整 pH 值到 9.5碱性磷酸酶的缓冲液TE 缓冲液10mM Tris-HCl 1 mM
28、 EDTApH 8.015-25,稳定终止颜色反响试剂盒工作溶液的制备溶液封阻溶液成分/制备方法用马来酸缓冲液依据 1：10 的比例将 10封阻液6 号瓶按体积比 10%溶解稀释成1工作溶液储存/稳定性用途现配现用封阻膜上非特异结合位点每次使用前将原始管中的anti-digoxigenin-AP(4号与地高辛标记的探针结合抗体结合的可视化下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：抗体溶液管)10000rpm 离心 5 分钟。然后从外表留神吸取所需用2-8，12h量。用封阻溶液依据 1：5000150mU/mL的比例稀释anti-digoxigenin-AP底物显色液取 200L NBT/BCIP(5
29、 号管)于 10ml 检测缓冲液中混匀即配即用留意：避光保存操作步骤此表描述了完成一张 100cm2 膜的免疫检测方法。留意：全部的孵育均是在 15-25下，振荡完成的。假设膜还需要再次与探针杂交，那么任何时候都不要让膜干。步骤操作1杂交和严谨洗涤后，将膜简洁的用洗涤缓冲液冲洗 1-5 分钟2在 100mL 封阻液中孵育 30 分钟3在 20mL 抗体溶液中孵育 30 分钟4用 100mL 洗涤缓冲液洗涤两次，每次 15 分钟5在 20mL 检测缓冲液中平衡 2-5 分钟将孵育膜放入盛有预备好的 2ml 底物显色液的盒子中，避光。在显色过程中不能摇动。8留意：几分钟后沉淀颜色开头形成，短时间内
30、可适当翻开盒子观看染色情况9当得到预期的斑点或者聚焦强度已经完成，则停顿反响，用无菌双蒸水50ml或者TE 缓冲液洗膜 5min结果可以用影印湿过滤器或者摄影记录假设那么你想再探讨这块膜膜在任何时候都不能干掉，存储在密封塑料袋中你不想探讨枯燥膜，储存在 15oC-25oC留意：枯燥后颜色变淡，为使颜色恢复，可用 TE 缓冲液润湿3.7 DNA 印记的洗脱和再次探针杂交主要信息印记中的碱性标记形式的DIG-11-dUTP 能够更简洁更有效的被洗脱，以用于再一次的杂交试验。所需附加的仪器和试剂DMF2SSC0.2N NaOH, 0.1% SDS操作步骤此操作描述的是膜的洗脱。步骤操作用大烧杯水浴加热DMF 到 50-601将膜放入其中直到蓝色颗粒从膜上脱落双蒸水充分洗涤2在 37条件下，用含有 0.1%SDS 的 0.2M NaOH 洗涤两次，每次 20 分钟，以去除地高辛标记的探针3用 2SSC 充分洗涤 5 分钟4空气中枯燥或用另一个探针进展预杂交和杂交留意：假设打算印记需要洗脱和再次杂交，那么膜在任何时候都不能干。 可选择的洗脱方法，用于filter 杂交的地高辛应用操作手册中提到的可以通互联网获得洗脱后的膜需要的储存条件一旦膜被洗脱，可以将膜放在马来酸缓冲液中或者2SSC 中预备再用。4 结果5 附录