《发酵低醇西瓜果酒产香酵母的分离筛选及香气成分分析.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《发酵低醇西瓜果酒产香酵母的分离筛选及香气成分分析.docx（7页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、发酵低醇西瓜果酒产香酵母的分别筛选及香气成分分析申光辉;黎梅;王玥;杨红霞;唐倩;刘小英;张志清【摘 要】为获得适宜低醇西瓜果酒发酵的酵母菌株,以嗅闻香气和总酯产量为指标, 从传统白酒酒曲中分别筛选获得 5 株产香酵母.通过菌株形态、生理生化特征,结合26S rRNA 序列分析,将菌株 Z133 鉴定为特别威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus),菌株 Z2、Z31、Z32 和 Z43 鉴定为扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera).菌株 Z133 可产浓郁的果香气味,对糖、SO2 及乙醇均有良好的耐受性, 可发酵西瓜汁获得乙醇体积分数 5
2、.6的低醇西瓜果酒.承受顶空固相微萃取-气质联用法分析觉察,酒体中醇类和酯类香气成分种类和相对含量高于未发酵西瓜汁,主要香气成分苯乙醇、乙酸香叶酯和乙酸异戊酯的相对含量分别为 25.65、6.41 和 3.93.结果说明,从酒曲获得的产香酵母菌株 Z133 在低醇西瓜果酒发酵中具有肯定的应用价值.【期刊名称】食品与发酵工业【年(卷),期】2023(042)008【总页数】6 页(P103-108)【关键词】产香酵母;低醇西瓜果酒;香气成分;顶空固相微萃取【作 者】申光辉;黎梅;王玥;杨红霞;唐倩;刘小英;张志清【作者单位】四川农业大学食品学院,四川雅安,625014;四川农业大学食品学院,四川
3、雅安,625014;四川农业大学食品学院,四川雅安,625014;四川农业大学食品学院, 四川雅安,625014;四川农业大学食品学院,四川雅安,625014;四川农业大学食品学院,四川雅安,625014;四川农业大学食品学院,四川雅安,625014【正文语种】中 文西瓜(Citrullus lanatus Thunb.)瓤甜多汁，富含糖类、有机酸、维生素等养分功能成分，深受消费者宠爱。由于产期集中、不耐贮存，常以鲜食为主。利用西瓜汁发酵果酒是缓解西瓜滞销问题，提高产品附加值的有效途径。风味淡薄是目前大局部果酒生产中迫切需要解决的问题1。发酵菌种是影响果酒口感风味的重要因素之一，而目前西瓜果酒
4、多用葡萄酒酵母发酵2，筛选适合西瓜果酒发酵的优良酵母菌种的争论工作开展较少，且多以菌株产乙醇力量为指标3，无视了菌种的发酵产香性能对果酒风味的乐观影响。产香酵母属于可产醇、醛、酯等多种芳香物质的非酿酒酵母，能够乐观转变酒体的化学成分，对酒的感官风味品质有特别的奉献， 可改善传统酿酒酵母酿制的果酒风味，在果酒生产中应用潜力巨大4-11。酒曲是我国传统白酒酿造的发酵生香剂，蕴含着产香酵母在内的多样化酿酒功能菌资源12-14。本试验从酒曲中分别筛选适于低醇西瓜果酒发酵的产香酵母，进展菌株分类鉴定和发酵性能测定，并检测发酵低醇西瓜果酒香气成分，以评价该菌株用于发酵低醇西瓜果酒的可行性。酒曲：中温曲和中
5、高温成熟曲，由四川省泸州市某酒厂供给。西瓜：市售成熟西瓜。麦氏培育基(g/L)：葡萄糖 1.0，氯化钾 1.8，酵母膏 2.5，醋酸钠 8.2，pH 自然， 115 灭菌 15 min 。YPD 培育基(g/L)：葡萄糖 20.0，蛋白胨 20.0，酵母膏 10.0， 琼脂 15.0，pH6.0，115 灭菌 15 min。PDA 培育基(g/L)：马铃薯(去皮)200.0， 葡萄糖 20.0，琼脂 15.0，pH 自然，121 灭菌 20 min。豆芽汁培育基：取黄豆芽 200.0 g 加适量水煮沸 30min，纱布过滤得豆芽汁，加葡萄糖 20.0 g 溶解， 补水至 1 000 mL，12
6、1 灭菌 15 min10。西瓜汁培育基：鲜西瓜取瓤榨汁过滤，用蔗糖调整糖度至 18Bx，pH 自然，115 灭菌 15 min。SHP-160 生化培育箱，上海三发科学仪器；GI54DWS 高压灭菌器，致微(厦门)仪器；SW-CJ-2D 双人单面干净工作台，苏净安泰空气技术有限公司；Nikon Eclipse E100 光学显微镜，南京贝登生物科技；UV-3100PC 紫外分光光度计，上海美普达仪器；JA1203B 电子天平，上海越平科学仪器；ZWY-2102C 恒温培育振荡器，上海智城器制造。PX-B32T 型水果糖度仪，广州市普析通仪器；Agilent 7890A- 5975C 气相色谱
7、-质谱联用仪，美国 Agilent 公司；SPME 手动进样器、15 mL 进样瓶、57328-U 手动固相微萃取装置、50/30 m DVB/CAR/PDMS 固相微萃取纤维头，美国 Supelco 公司。称取 5.00 g 酒曲粉碎样品参加到 100 mL 无菌水制成悬液，取 1.0 mL 参加到 9.0 mL 麦氏培育基试管中，28 ，120 r/min 振荡富集培育 24 h。富集培育液梯度稀释，取 10-2、10-3、10-4、10-5 梯度稀释液各 100L，分别涂布于 YPD 平板， 28 培育 48 h。挑取酵母样菌落进展镜检，反复平板划线法纯化后接种于 PDA斜面，28 培育
8、 48 h，4 保藏备用。将分别菌株划线接种于 YPD 平板上，28 培育 35 d，通过嗅闻法15初步推断是否有酯香或醇香，筛选具有较浓酯香气或特别果香气的菌株。将初筛获得的酵母菌接种于 PDA 液体培育基中，28 活化培育 24h 至酵母菌数为 108CFU/mL。将酵母菌活化液用按体积分数 0.4%接入装有 200 mL 豆芽汁液体培育基的 250mL 三角瓶中，28 下静置培育 3 d。取 150 mL 培育液转入 250 mL 圆底烧瓶中， 承受回流皂化法16测定培育液总酯含量(以乙酸乙酯计)，筛选出产酯量较高的菌株。参照酵母菌的特征与鉴定手册17，进展菌株形态学观看和生理生化特征测
9、定。承受酵母基因组提取试剂盒提取酵母总 DNA。引物承受 NL1：5- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3，NL4：5- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3。50 L PCR 扩增反响体系：Taq 酶 0.25L、Buffer 5 L、dNTP 4 L、DNA 模板 1L、引物 NL1/NL4 各 1L。PCR 反响程序：94 预变性 5 min，94 变性 1 min，48 退火 1 min，72 延长 1 min，30 个循环。PCR 产物用凝胶回收试剂盒纯化后，送成都擎科梓熙生物技术测序。测得序列与 GenBank 数据库进展 BLAST 比对，选取相像度较高的
10、模式菌株序列，用 ClustalX1.83 软件进展序列比对，用 MEGA 5.1 软件，Neighbor-Joining 法构建系统发育树。制备不同初始糖度、不同 pH、不同 SO2 质量分数及不同乙醇体积分数的灭菌西瓜汁培育基，按 1105 CFU/mL 接种量接入酵母菌种子液，28 培育 48 h，血球计数法测定酵母细胞总数，以考察菌株对糖度、酸度、SO2 及乙醇的耐受性。同时将一样接种量的西瓜汁培育基在不同温度下培育 48 h 计数，考察菌株温度耐受性。将榨汁过滤的西瓜汁，用蔗糖调整糖度至 20Bx，柠檬酸调 pH 至 4.0，添加 80 mg/L SO2，按 1105CFU/mL 接
11、种量接入酵母菌种子液，30 发酵 6d 后过滤澄清，获得低醇西瓜果酒。发酵过程中总糖、总酸及乙醇体积分数测定参考 GB/T 15038202318。承受顶空固相微萃取-气质联用法8, 15。取 5mL 果酒(或西瓜汁)于 15 mL 顶空瓶中 60 恒温水浴平衡 5 min，将老化好的固相微萃取头插入顶空瓶中萃取 30 min，移入 GC-MS 进样口解吸 3 min，分析香气成分。色谱条件：毛细管色谱柱Agilent HP-5MS(30 m250 m，0.25m)；手动不分流进样，进样口温度250 ；程序升温：初始温度 40 ，保存 2 min，以 5 / min 到 220 ，保存 2 m
12、in；检测器温度 250 ；载气 He，流速 1 mL/ min。质谱条件：EI 电离源，230 ，电子能量 70 eV，四极杆温度 150 ，质量扫描范围 50550 u。未知化合物经计算机检索同时与 NIST11 谱库匹配，对匹配度大于 80 的化合物进展分析，峰面积归一法计算香气成分的相对含量。试验结果以平均值标准差表示，用 DPS 7.05 软件，Duncans 复极差法进展结果显著性差异分析。从 YPD 平板上挑出具有酵母菌典型特征的菌落，结合显微形态观看从中温酒曲分别获得 36 株酵母菌株，中高温曲未分别到酵母菌。将分别纯化的 36 株酵母菌划线于 YPD 平板上，28 培育 35
13、 d，通过嗅闻初步筛选出风味严峻、有发酵香气的 5 株菌 Z133、Z2、Z31、Z32、Z43，其中 Z133 菌株具有特别的果香味。将具有发酵香气的 5 株酵母菌接种到豆芽汁培育基中静止培育 3 d，测定培育液总酯含量。由表 1 可见，酵母菌株 Z31 培育液总酯含量最高，为 0.48 g/L，菌株 Z133 培育液总酯含量最低，但其发酵具有浓郁的果香香气，而其他 4 株酵母香气较淡。5 株产香酵母菌的菌落形态和细胞形态特征见表 2 和图 1。表 3 是 5 株酵母生理生化特征结果，依据酵母菌的特征与鉴定手册初步将Z133 鉴定为威克汉姆酵母属 Wickerhamomyces，Z2、Z31
14、、Z32 和 Z43 鉴定为复膜孢酵母属 Saccharomycopsis。将菌株 26SrRNAD1/D2 片段序列测序结果与 GenBank 数据库中酵母模式菌株基因序列进展 BLAST 比对，选取相像度较高的标准菌株序列，Neighbor-Joining 法构建系统发育树。由图 2 可见，菌株 Z133 与特别威克汉姆酵母 Wickerhamomyces anomalus NRRL Y-366(GenBank 登录号：U74590)聚在同一分支，且支持率 100%，Z2， Z31，Z32，Z43 四株菌与扣囊复膜酵母 Saccharomycopsis fibuligera(GenBank
15、 登录号：U40088)聚在同一分支。因此，结合形态学和生理生化特征，将 Z133 鉴定为特别威克汉姆酵母 W. anomalus，Z2，Z31，Z32， Z43 鉴定为扣囊复膜酵母 S.fibuligera。果酒发酵酵母生长发酵的耐受性能是评价菌株发酵力量的重要方面，同时也是进展果酒发酵条件掌握的主要依据。由表 4 可知，菌株 Z133 生长温度范围较宽，在30 生长发酵最快。在 1525Bx 的糖度范围内生长良好，最低可耐受 pH3.0的酸性环境。此外，该菌株对 SO2 和乙醇的耐受性良好，最高可耐受 200 mg/L 的 SO2 浓度及体积分数 12%的乙醇。本试验筛选获得 5 株产香酵
16、母中，菌株 Z133 总酯产量虽然不高，但其培育液具有 浓郁的果香气味。因此以菌株 Z133 为发酵菌株，按 1.7.1 方法发酵低醇西瓜果酒， 获得的西瓜果酒酒体金黄色，清亮透亮，光泽较好，有浓郁的酒香气和西瓜果香， 酸甜适口，酒体较完整，饶有余味。由表 5 可见，Z133 可消耗利用承受顶空固相微萃取结合气质联用法检测分析了西瓜汁与发酵西瓜果酒的挥发性香气成分。由表 6 可知，西瓜汁中挥发性香气成分较少，主要包括醛类、烯类、酸类成分，其中壬醛和柠檬醛为主要醛类物质，相对含量分别为 5.10%和 4.59%， 烯类包括 -甜没药烯、-姜黄烯和 -柏木烯，相对含量分别为 3.14%、1.25%
17、和2.17%，此外葵醚相对含量 2.86%。本试验检测到的挥发性化合物种类相对于其他争论结果19-20较少，这除了与所用西瓜材料品种及成熟度有关外，还与所用挥发性物质萃取分别分析的技术条件有关。相对于未发酵西瓜汁，Z133 发酵 6 d 获得的低醇西瓜果酒增加了 4 种醇类和4 种酯类挥发性香气成分。其中乙醇、苯乙醇是主要醇类物质，相对含量分别为4.81%和 25.65%，而酯类主要为乙酸异戊酯和乙酸香叶酯，相对含量分别达 3.93% 和 6.41%。结果说明菌株 Z133 赐予西瓜果酒独特的感官风味与其发酵代谢西瓜汁过程中产生的醇类和酯类物质有关。本试验从白酒中温曲中分别到 5 株产香酵母，
18、包括 1 株特别威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus 和 4 株扣囊复膜酵母 Saccharomycopsis fibuligera，均是酱香型21和浓香型12酒曲中常见的优势非酿酒酵母。本试验觉察特别威克汉姆酵母 Z133 豆芽汁培育液总酯含量虽然不高，但其发酵的西瓜果酒具有怡人的浓郁果香味，同时在生长耐受力量方面具有发酵低醇西瓜果酒的应用潜力。低醇果酒是乙醇体积分数为 1%7%的发酵果酒18，可削减高酒精度对身体安康的危害，且口感严峻，受到越来越多的消费群体，特别是酒精耐受力较弱人群的青睐。同时乙醇浓度对果酒芳香风味有着重要影响，较高的乙醇含量降低一些香气成分的奉献
19、率，导致果酒芳香度降低，风味更淡22-23。低醇果酒能以较低的乙醇含量改善目前果酒风味淡薄的问题，近年来渐渐成为果酒争论的重要趋势。而非酿酒酵母乙醇产量低的代谢特点正适合于发酵低醇果酒，是发酵低醇果酒的重要方式24。本试验筛选获得的特别威克汉姆酵母 Z133 发酵 6 d 即可获得乙醇体积分数 5.6% 的低醇西瓜果酒，同时代谢产生多种醇类、酯类香气化合物，赐予其独特的发酵醇香和酯香气。其中苯乙醇相对含量最高，为 25.65%，在其他来源的特别威克汉姆酵母产香代谢物争论中均有报道8, 25-27。本争论从白酒酒曲中分别筛选获得 5 株产香酵母菌株，经鉴定分属于特别威克汉姆酵母和扣囊复膜酵母。其中特别威克汉姆酵母 Z133 产果香力量强，能够耐受200 mg/L SO2 及体积分数 12%的乙醇，以其发酵获得的低醇西瓜果酒乙醇体积分数 5.6%，含有苯乙醇、乙酸异戊酯、乙酸香叶酯等香气成分。Z133 具有发酵低醇西瓜果酒的潜力。