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1、本科学生试验报告学号104120440姓 名孙 永 升学院生命科学学院专业、班级10 生物技术试验课程名称发酵 工 程 学 教师及职称唐湘华 开课学期2023至2023学年其次学期填报时间2023年5月15日云南师范大学教务处编印试验名称试验方式小组成员XX XX试验 六 细菌液体发酵生产淀粉酶小组合作XXXX一、 试验原理及内容1、 试验目的1.1 了解产淀粉酶的微生物；1.2 了解液体发酵操作过程；1.3 了解发酵罐的构造构成； 2、 试验设备及材料2.1 发酵培育基蛋白胨 2 ,酵母膏 1,木薯淀粉 2,氯化钠 0.2%。pH 6.0 ，121，灭菌30min。2.2 菌种：T4 细菌2
2、.3 器材：三角瓶、烧杯、天平、灭菌锅、超净工作台、培育箱，发酵罐，摇床等。3、试验原理及试验流程或装置示意图：3.1 试验原理：将产淀粉酶的枯草芽孢杆菌 T4 细菌接种于富含淀粉的培育基中诱导发酵产生淀粉酶。微生物生产的 a-淀粉酶可以说是一种半合成酶大多数工业生产的淀粉酶菌种，如；枯草杆菌、米曲霉、淀粉液化芽孢杆菌等，即使培育基种不含淀粉或者不含有具有 a-1、4 键的多糖或低聚糖，仍旧可以生产 a-淀粉酶，但是它们的产量可受到淀粉或其它 a-1，4 麦芽寡糖的诱导而增加。氮源：是合成 a-淀粉酶的原料有机氮：各种氨基酸与酪蛋白的酶水解物有利于 a-淀粉酶的生成。实际生产中， 酪蛋白、豆饼
3、的热、碱水抽出物是工业上最优良的氮源。无机氮：硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸铵及尿素等无机氮均可在不同程度上增加 a-淀粉酶的产量，但大多喜用硝酸钠。整个试验依据“菌种的培育、空消、实消、接种、发酵、放罐”的发酵过程进展。在整个发酵的过程中，每隔 6h 取一次发酵液样品检测其 pH 值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最终将所测数据进展整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培育条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。3.2 装置示意图: 图一 200L 发酵罐与种子罐。发酵罐图一3.3 操作流程工艺图：整个试验依据“菌种的培育、空消、
4、实消、接种、发酵、放罐”的发酵过程进展。在整个发酵的过程中，每隔 6h 取一次发酵液样品检测其 pH 值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最终将所测数据进展整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培育条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。4. 操作步骤、留意事项：4.1 操作步骤1、装料，开动搅拌，定容后，参加食用油 10 毫升用于消泡；2、排空夹套水，通入蒸汽对物料加热，三路进汽；物料温度升到 80 ，停顿搅拌。3、排空冷空气，升压到 0.1MPa,保压 30min；4、夹套降温，物料温度降到 80，启动搅拌，留意罐压，当罐压降到 0.0
5、5MPa 时，通入空气，保持罐压在 0.07Mpa；5、温度降低到 37 就可以接种，接种方式承受火焰烧；6、依据通风比和掌握参数要求进展罐压、搅拌的调整。4.2 方法与留意事项一原则 1通蒸汽前先关闭全部阀门2. 粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必需关闭通向粗过滤器的阀门。3. 活蒸汽，灭过头，即尾汽不能关死，要保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分压。4. 罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。5. 空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。但空消一完毕，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避开染菌。 6进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门，完毕时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，完毕时先关
6、主阀后关尾阀。7. 蒸汽一停，即由无菌空气充入保持罐内正压。8. 蒸汽对设备与物料灭菌中留意安全，掌握时间、压力限制。9. 操作中留意发酵参数监测与掌握。二 空消：先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进展：1. 先关闭全部阀门，检查处是否关严密封，翻开罐上方排气口。2. 蒸汽先进空气系统，蒸汽蒸汽过滤器分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，翻开主阀。 3再进罐体：由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统两边。4罐压升至所需温度121时开头计时，保温保压 30min。保压方式：1调整主汽路进汽阀门掌握进汽量；2调整排气口排
7、气量大小或尾阀放汽量。5完毕空消：（1） 逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。（2） 同时预备好压缩空气确保蒸汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。近罐空气阀的尾阀要始终微开启。留意：空消前应检查夹套中是否残留了冷水，假设有，影响罐体升温，须自夹套出水口将水放出。三种子制备：液体摇瓶培育。四培育基配制、实消：关闭气路入罐阀，主汽路进汽补料口进汽方法同空消罐压升至 0.12Mpa121，保压、保温 30 分钟实消完毕。五冷却接种与发酵：1、待培育基冷却至 28左右时，在加料口四周放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下翻开进料口，快速接种。2、将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进展发酵。六
8、参数监测每隔 6 h 取一次样，检测其 pH、生物量、酶活及残糖含量等指标。. pH 的测定：标准液校准 pH 计后，测定样品 pH 值。. 生物量的测定：每次取 20-30mL 的发酵液，先用大离心机(5000 rpm, 35 min)离心，收集上清液，用小离心机10000rpm，1min用来测酶活，沉淀用水清洗几次后再离心，然后将所得沉淀放入 100烘箱中，烘干2 h 左右，然后测其干重，取平均值。. 酶活：DNS 法测定淀粉酶活七后续工作：罐体清洗，药品整理归类，物品放好。二、试验结果及分析1.1 枯草芽孢杆菌 T4 发酵过程形态观看：发酵液浑浊黄色，恶臭味。对发酵液用番红染色观看呈杆状
9、，无杂菌污染。如图二图二 发酵液番红染色结果1.2 淀粉酶活测定：酶活力单位U/ml= K(ODA + ODB )/2 + bN103 /10/0.2/180.2式中：ODAA 管的吸取光度值； 103mg 转换为 ug； ODBB 管的吸取光度值； 180.2葡萄糖的摩尔质量； N酶液的稀释倍数； 10表示酶反响时间为 10min； K：标准曲线斜率。回归直线方程 y=kx-0.0747，k=0.7023。酶活力单位U/ml= K(ODA + ODB )/2 + bN103/10/0.2/180.2=0.794U/ml结果与争论：对发酵液跟踪监测菌染：形态观看无污染，根本为枯草芽孢杆菌 T4
10、。由于测定时未完全真确按六小时测定一次，酶活测定觉察测定结果较低。依据发酵时间总体上是呈上升趋势，测定过程中只对发酵液：液体、菌体简洁离心操作，未作发酵液提纯压缩处理，等于酶液稀释较低水平，因此结果低。三、试验小结通过亲自体验本次试验，能够真正了解到微生物发酵的过程，将课本上的东西都结合到试验来，并且对一些不理解的器具也有了充分的生疏，包括对发酵罐各个部件的，各个管路的生疏以及他们的作用。在操作过程中我们要严格自己的操作,试验测量的数据要保持真实性。最重要的是把握一般发酵罐的常规操作、流程。可以更好地为实习打下根底，提高操作技能水平。参考文献1 金明晓,赵丹丹. 根霉液体发酵产淀粉酶条件优化的争论J. 吉林工程技术师范学院学报,2023,12(19):5254.2 罗军侠,李江华,陆健,房俊. 耐酸生淀粉糖化酶的菌种筛选、酶的性质及发酵条件J. 食品工业科技, 2023(05):151154.指导教师评语及得分： 签名： 2023 年 05 月 日