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1、学兔兔标准下载T/SPPHN001-2023ICS01.040.65CCSB15/19T/SPPHN湖南省植物保护学会团体标准T/SPPHN001-20232.0亿CFU/mL嗜硫小红卵菌HNI-1悬浮剂RhodovulumsulfidophilumHNI-12.0108CFU/mLSC23-11-20发布2023-11-20实施湖南省植物保护学会发布学兔兔标准下载T/SPPHN001-2023前言本文件是根据GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由湖南省植物保护研究所
2、提出。本文件由湖南省植物保护学会归口。本文件起草单位：湖南省植物保护研究所、中国农业科学院植物保护研究所、宁波大学、湖南新长山农业发展股份有限公司。本文件主要起草人：刘勇、张德咏、李方方、张松柏、羊健、燕飞、史晓斌、戴建平、苏品、周波、罗香文、王忠勇、张体伟。项目技术指标有效活菌数CFU/mL82.010杂菌率(%)10水不溶物质量分数(%)0.2pH值6.58.5学兔兔标准下载T/SPPHN001-20232.0亿CFU/mL嗜硫小红卵菌HNI-1悬浮剂1范围本文件规定了2.0亿CFU/mL嗜硫小红卵菌HNI-1悬浮剂的要求、试验方法、检验规则、标志、包装、贮运、安全和保证期。本文件适用于以
3、嗜硫小红卵菌活菌体加工而成的悬浮剂。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1601农药PH值的测定方法GB/T1604商品农药验收规则GB/T1605-2001商品农药采样方法GB/T3796农药包装通则GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T14825-2006农药悬浮率测定方法GB/T16150-1995农药粉剂、可
4、湿性粉剂细度测定方法GB/T28136-2011农药水不溶物测定方法GB/T28137-2011农药持久起泡性测定方法GB/T31737-2015农药倾倒性测定方法HG/T2467.6-2003农药水剂产品标准编写规范3术语和定义本文件无术语和定义。4要求4.1组成与外观本品为红色液体，有轻微臭味，存放过程中可能出现轻微沉淀，但经摇匀后应恢复原状。4.2产品技术指标应符合表1的要求表12.0亿CFU/mL嗜硫小红卵菌HNI-1悬浮剂控制项目指标1悬浮率（有效成分）/（%）80倾倒性倾倒后残余物/（%）5.0洗涤后残余物/（%）0.5持久起泡性（1min后泡沫量）/mL1.0细度（75m）/（%
5、）98稀释稳定性合格低温稳定性a)合格热贮稳定性b)合格a)，b)注：低温稳定性、热贮稳定性实验，在正常生产时每3个月至少进行一次。学兔兔标准下载T/SPPHN001-20235试验方法5.1一般规定本标准所有试剂和水在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682-2008中规定的三级水。检验结果的判定按GB/T8170中的4.3.3修约比较法进行。5.2抽样按照GB/T1605-2001中“液体制剂采样”方法进行，用随机数表法确定抽样的包装件数，最终抽样量不少于200mL。5.3有效活菌数与杂菌率的测定有效活菌数采用最大可能数计数法（MPN）测定；杂菌数采用平板菌落计数法测定，测出杂
6、菌数（包括细菌和霉菌）后，再按照杂菌率的计算方式进行计算。5.3.1试剂和溶液无菌水；光合细菌的双层培养基：遵照附录D的规定；有效活菌数测定用培养基：遵照附录D的规定；杂菌数测定用培养基：细菌培养基按GB/T4789.28-2003中4.8规定，霉菌培养基遵照附录D的规定。5.3.2试验仪器手持扩大镜（10倍）；V8漩涡混合器（转速范围：200rpm/min3000rpm/min，无级调速）；ECC-150A恒温培养箱控温范围：RT+580，温度显示精度：0.1，控温精度：0.1，控温均匀度：0.5(37时)；EOF-150A恒温烘箱控温范围：RT+10220，温度显示精度：0.1，控温精度：
7、1，控温均匀度：1.5(150时)；高压蒸汽消毒器；灭菌的培养皿：直径9cm；灭菌的螺口试管、灭菌的锥形瓶；灭菌的玻璃刮刀；灭菌的0.5mL、l.0mL、15mL吸管。2学兔兔标准下载T/SPPHN001-20235.3.3菌株鉴别根据代表菌株的形态学和生理生化特征进行菌种鉴别，并可辅助结合16SrDNA基因序列分析等手段。当对鉴别结果有争议或者需要进行法律仲裁检验时，应到具有菌株鉴定资质的单位，将待检菌株与模式菌株进行比对，出具菌种鉴定报告，作为仲裁依据。有效成分的特征参见附录A。菌种鉴别方法参见附录B。16SrDNA基因序列分析进行菌种鉴别参见附录C。5.3.4有效活菌数的测定采用平板菌落
8、计数法（A）或最大可能数法（MPN法）（B）测定有效活菌数量。A.平板菌落计数法（1）仪器设备：9cm灭菌培养皿30个、移液枪1mL、10mL、灭菌枪头、涂布棒、超净工作台、2mL灭菌离心管10个、封口膜或保鲜膜。（2）光合细菌双层平板培养基参见附录D。（3）操作步骤：1）菌液稀释将菌液用无菌水于2mL离心管中逐级稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等十个浓度，分别做好标记。2）培养基的配置按要求分别配置上层和下层培养基，灭菌备用。3）倒下层培养基融化下层培养基，倒平板（约33mL/板）超净工作台中冷却待用。4）涂菌按无菌操
9、作要求，用移液枪吸取100L菌液到冷却凝固的下层培养基上，用涂布棒涂抹均匀。5）倒上层培养基融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50左右时，将其倒入已涂菌的下层培养基上，超净工作台中冷却至室温。6）用封口膜或保鲜膜将培养皿密封7）放置于301的恒温培养室，在2500lx3000lx的白炽灯下光照培养7d10d，倒置培养。注：每个浓度重复三次。（4）活菌数的计算方法可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。选取菌落数在30CFU300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。若三个
10、稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最接近300或30的平均菌落乘以稀释倍数。B.最大可能数（MPN）法（1）试验仪器：10mL螺口试管20个、灭菌、试管架、移液枪10mL或5mL、1mL、灭菌枪头、超净工作台、封口膜或保鲜膜。3学兔兔标准下载T/SPPHN001-2023（2）光合细菌培养基配方：有效活菌数测定用培养基，配方参见附录D。（3）操作步骤：选取10-8、10-9、10-10三个浓度梯度的稀释液做测定用。取20支装有9mL
11、培养基的灭菌螺口试管，分别按3管一组标记为10-8、10-9、10-10、CK。用1mL灭菌枪头按无菌操作要求吸取每个浓度梯度的稀释液各1mL放入对应编号的试管中，拧好试管盖。标记为CK的3支试管加入灭菌水1mL做对照。放置于301的恒温培养室，在2500lx3000lx的白炽灯下光照培养7d10d，统计每个浓度下三支试管整支变红的管数，将变红管数在三个浓度下的分布形式对应到MPN表（见附录E），获得相应的MPN数值，MPN值107即为样品中有效活菌数浓度。5.3.5杂菌率的测定5.3.5.1细菌数的测定与计算方法(1)细菌数的测定选取10-5、10-6、10-7三个浓度梯度的稀释液，用0.5
12、mL无菌吸管吸取0.1mL，分别加至含有15mL营养肉汤培养基的培养皿(直径为9cm)表面，用无菌玻璃刮刀将稀释液均匀涂布，待菌液全部渗入培养基后，放置于361的恒温培养箱内倒置培养482h。每一浓度重复三次，同时设置加无菌水的空白对照。用肉眼计数菌落，必要时可借助手持放大倍数为10倍的扩大镜。(2)细菌数的计算方法以平板上出现30个300个菌落数的稀释度平板为计数标准。当只有一个稀释度，其平均菌落数在30300之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释度倍数。若有两个稀释度，其平均菌落数均在30300之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比例小于2应计数两者的平均数。若大于2则计数其中稀释较小的
13、菌落总数。若三个稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀释倍数。若三个稀稀度的平均菌落数均不在30300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。5.3.5.2霉菌数的测定与计算方法(1)霉菌数的测定选取10-5、10-6、10-7三个浓度梯度的稀释液，用0.5mL无菌吸管吸取0.1mL，分别加至含有15mL马丁培养基的培养皿表面，用无菌玻璃刮刀将稀释液均匀涂布，待菌液全部渗入培养基后，放置于2528的恒温培养箱内，3d后开始观察，共培养观察5d。每一浓度重复三次，同时设置加无菌水的
14、空白对照。用肉眼计数菌落，必要时可借助手持放大倍数为10倍的扩大镜。(2)霉菌的计算方法通常选择菌落数在10150之间的平皿进行计数，同稀释度的2个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每毫升检样中所含的霉菌数。5.3.5.3杂菌率的计算方法4学兔兔标准下载T/SPPHN001-2023菌剂含杂菌率(X)按下式计算：式中：X杂菌率，%；Z1杂菌数(包括细菌和霉菌)，CFU/mL；Z2有效菌数，CFU/mL。5.4水不溶物质量分数的测定按GB/T28136-2011农药水不溶物测定方法测定。5.5pH值测定按GB/T1601的规定进行测定。5.6悬浮率测定5.6.1实验仪器1)量筒：250mL具塞量
15、筒、100mL普通量筒；2)真空吸液器；3)秒表；4)三角瓶：250mL；5)恒温水浴锅。5.6.2标准硬水配制方法按GB/T14825-2006中标准硬水配制方法进行。5.6.3操作步骤将样品摇匀取5.00mL(精确到0.01mL)，于250mL三角瓶中，加入标准硬水100mL，用手旋转振荡50次后转移到250mL具塞带刻度量筒中，三角瓶用标准硬水清洗两次，清洗液一并收集到250mL具塞带刻度量筒中，用标准硬水定容到250mL。将量筒放入（302）恒温水浴锅中放置5min，将量筒盖好，左手托住量筒底部，右手握住量筒顶部并用食指按住塞子，颠倒量筒30次充分混匀，打开量筒塞子后重新将其放入恒温水
16、浴锅中，竖直静置30min。用真空吸液器自上而下将上层液体抽走225mL，抽液过程中调整适当的真空度，吸液管嘴紧贴量筒管壁并保持在液面下3mm5mm处跟随液面下降，勿搅动下部沉淀。量筒内余留的25mL悬浮液，按5.3.4进行有效活菌数的测定，此活菌数浓度记为C1。5.6.4计算样品中的悬浮率(Y)按下列公式进行计算Y=（1-C1/C0）1.1111100式中：C0步骤5.6.3中所取样品中的有效活菌数；C1量筒底部余留的25mL悬浮液的有效活菌数；1.1111换算系数5学兔兔标准下载T/SPPHN001-20235.6.5允许差两次重复测定结果之差应不超过10%。5.7倾倒性的测定按GB/T3
17、1737-2015进行。5.8持久起泡性的测定按GB/T28137-2011进行。5.9细度的测定按GB/T16150-1995中2.2进行测定，使用200目、孔径75m的标准筛。5.10稀释稳定性实验按HG/T2467.6-2003中4.9进行。静置1h后，如稀释液均一，无析出物为合格。5.11低温稳定性实验5.11.1实验仪器低温恒温培养箱：（120）1；烧杯：100mL。5.11.2实验方法取80mL试样置于100mL烧杯中，在低温恒温箱中（62）保持1h，期间每隔15min搅拌1次，每次15s，观察外观有无变化。将烧杯放回低温恒温箱中，（62）继续放置7天。7天后将烧杯取出恢复至室温，
18、测试有效活菌数应大于等于2.0108亿CFU/mL，则符合标准要求判定为合格。5.12热贮稳定性实验5.12.1方法提要试样在（452）恒温环境下，密封保存14d，取出测试其有效活菌数。5.12.2实验仪器恒温箱（或恒温水浴锅）：（1099）2；45仍能密封的具塞玻璃瓶：50mL；医用注射器：50mL。5.12.3实验步骤用注射器将约30mL试样，注入洁净的玻璃瓶中，置此玻璃瓶于冰盐浴中致冷，用塞子迅速封口。至少封3瓶，分别称量。将封好的玻璃瓶置于金属容器内，再将金属容器放入（452）恒温箱（或恒温水浴锅）中，放置14d，取出冷至室温，将玻璃瓶拭净，于24h内，按本标准4.3规定的方法进行检测
19、，测试有效活菌数应大于等于1.6108亿CFU/mL，则符合标准要求判定为合格。6检验规则6学兔兔标准下载T/SPPHN001-2023符合GB/T1604有关规定。数值修约规则和极限值按GB/T8170处理。7标志、标签、包装、贮运、安全和保证期7.1标志、标签、包装、贮运产品的标志、标签和包装应符合GB3796的规定。采用聚乙烯塑料瓶包装或铝箔袋包装。外包装采用塑料桶或纸箱。也可根据用户要求或订货协议，采用其他形式的包装，但需符合GB3796中的有关规定。本产品应贮存于640、干燥、阴凉的库房内，不得露天堆放，以防雨淋和日晒，避免阳光直射，防止长时间40以上高温。运输过程中应有遮盖物，防日
20、晒、雨淋及40以上高温。气温低于6时需用保温车运输。轻装轻卸，避免破损。7.2安全嗜硫小红卵菌悬浮剂属于微毒杀菌剂，操作时应穿戴好防护用品，如不慎溅到眼睛或皮肤，用大量清水冲洗干净，如误服请携标签立即送医院对症治疗。7.3保证期在规定的贮运条件下，从生产日期算起，保证期为1年。在保证期内，各项指标仍应符合表1参数的80%及以上的要求。7学兔兔标准下载T/SPPHN001-2023附录A（规范性）嗜硫小红卵菌HNI-1菌株来源：从海南省海水水样中分离、纯化获得。菌体形态见图A-1。图A-1嗜硫小红卵菌扫描电镜嗜硫小红卵菌属于光合细菌中的一种。光合细菌是地球上出现最早、具有原始光能合成体系的原核生
21、物，在自然界中普遍存在。是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，是一类没有形成芽孢能力的革兰氏阴性菌，因具有细菌叶绿素和类胡萝卜素等光合色素，呈现一定颜色。嗜硫小红卵主要生物学特性：细胞卵圆形至杆形，0.50.9m0.92.0m。单极生鞭毛运动或不运动，兼性厌氧光养菌。生理生化测试结果：革兰氏染色阴性，V-P反应阳性，甲基红反应阴性，不能利用淀粉，H2S反应阳性；可以利用多种小分子的有机酸（甲酸钠、乙酸钠、乳酸钠、丙酮酸）生长，也能利用部分糖类和醇类化合物（丙三醇、葡萄糖醇、肌醇、葡萄糖、木糖、蔗糖、甘露糖）进行生长，在蛋白胨和酵母膏中生长最好，不能利用NaHCO3；在883nm、808
22、nm、593nm、382nm有特征吸收峰；最适生长温度和PH分别为3035、pH7.0，培养物为红色，菌株在黑暗好氧条件生长慢、耐盐。嗜硫小红卵菌生物活性研究及应用评述：从海南省海水水样中分离出一株嗜硫小红卵菌，命名HNI-1，选取黄瓜霜霉病菌作为供试病原菌。采用FAO（1982年）推荐的叶盘漂浮法。根据每个叶盘上发病面积占该叶盘面积的百分率，计算光合细菌发酵液对黄瓜霜霉病的抑制率，发现发酵液稀释5倍时，抑制率均值为78.33%，发酵液稀释10倍时，抑制率均值为73.33%，发酵液稀释20倍时，抑制率均值为54.07%。HNI-1培养液对黄瓜幼苗具有显著的促生作用，当菌株培养液培养至对数生长期
23、后，将菌株培养液加入黄瓜幼苗水培营养液中，检测0天、3天、6天、9天、12天、15天后，幼苗的各项生物学指标。结果表明，菌株培养液对黄瓜幼苗的根长、生物量有显著的促进作用，且经菌株培养液处理后的黄瓜幼苗的过氧化物酶活显著提高，IAA含量和游离氨基酸的含量有显著提高。8特征嗜硫小红卵菌（R.sulfidophilum）亚德里亚小红卵菌（R.adriaticum）广海小红卵菌（R.euryhalinum）R.iodosumR.robiginosum苛求小红卵菌(R.strictum)细胞直径(m)0.6-0.90.5-0.80.7-1.00.5-0.80.5-0.80.6-1.0运动能力+-+-+
24、生长最适NaCl范围(%)1-62.5-7.50.5-122.5-52.5-50.8-1.0最适pH范围6.5-8.06.5-7.07.0-8.06.5;7.0-7.36.5;7.3-7.78.0-8.5好氧黑暗生长能力+-+硫化物耐受能力高（浓度1-2mM）高高ndnd高硫酸盐同化能力+-+生长因子需求b，n，p-ABA，tb，tb，n，p-ABA，tb，nb，nb，p-ABA，t氢气利用+-+-二价铁利用-+nd标准下兔学兔载T/SPPHN001-2023附录B（规范性）菌种鉴别生理生化特征法1主要仪器设备和材料除常规微生物试验操作所需要的设备和培养条件，其他还包括：万分之一天平；生物显微
25、镜（10100倍）；高压蒸汽灭菌锅；恒温培养箱；移液器；移液管；试管（15mL）及试管架；菌落计数器；匀质器；L形玻璃棒；培养皿（9cm）；载玻片；盖玻片；紫外分光光度计等。2主要培养基和试剂2.1试剂：结晶紫、乙醇、草酸氨、碘、碘化钾、丙酮、番红、过氧化氢、性氧化钠、肌酸、溴甲酚紫、可溶性淀粉、对二甲基氨基苯甲醛、浓硫酸、浓盐酸、L-酪氨酸、氯化钠、硝酸钾、-萘酸、二苯胺、乙醚、马尿酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钠、谷氨酸钠、生物素、尼克酰胺、硫胺素、对氨基苯甲酸等。2.2培养基：光合细菌的双层培养基（附录D）3形态学特征鉴别3.1染色：在光合细菌双层培养基上生长7296h的目标菌株涂片，空气干燥（
26、非热固定）后，进行革兰氏染色，蓝紫色为阳性，红色为阴性。3.2菌体观察：用生物显微镜观察菌体形态，细胞直径、运动功能等。3.3菌落形态观察：在光合细菌双层培养基上生长7296h，观察菌落的形态和产色素等。3.4培养条件：本方法内，除暗室培养特殊要求，所有光合细菌培养均在光照1500lux，30条件下进行；固体培养采用双层平板法，液体培养采用250mL血清瓶加满培养基至瓶口厌氧培养。4生理生化特征鉴别嗜硫小红卵菌（Rhodovulumsulfidophilum）及其近似种的生理生化特征检表B.1。表B.1嗜硫小红卵菌（Rhodovulumsulfidophilum）及其近似种的生理生化特征检表9
27、柠檬酸钠-+酒石酸钠-ndnd+甘露醇-+-甘油+-+-乙醇+-葡萄糖酸盐nd+ndndndndMol%G+C66.3-66.6(HPLC)，68.9-73.2(Tm)64.9-66.7(Tm)62.1-68.6(Tm)66(HPLC)69(HPLC)67.3-67.7(HPLC)碳源利用学兔兔标准下载T/SPPHN001-2023符号及缩写：+，阳性；-，阴性；，不同菌株中存在差异；b，生物素；n，尼克酰胺；t，硫胺素；p-ABA，对氨基苯甲酸；nd，未确定。4.1生长最适氯化钠范围(%)光合细菌培养基中加入不同浓度的氯化钠，起始浓度为0%，按0.25%为梯度，依次配置各个梯度浓度至10%。
28、将目标菌株采用250mL血清瓶液体光照培养（7296）h，与未接种的对照比较，目测生长情况。4.2最适pH范围用盐酸分别调节光合细菌培养基的pH值5.09.0。采用250mL血清瓶液体光照培养将目标菌株培养（7296）h后目测生长情况。4.3好氧黑暗生长能力在锥形瓶中加入瓶体积25%的用光合细菌培养基，接入培养基5%体积的目标菌株菌液，封口膜（可通气）封口后，在180rmp条件下暗室震荡培养，（7296）h后目测生长情况。4.4硫化物耐受能力光合细菌培养基中分别加入不同浓度的硫化物，起始浓度为0mM，按0.25mM为梯度，依次配置各个梯度浓度至最高浓度：硫化钠（3mM）、亚硫酸钠(0.5mM)
29、、硫代硫酸钠(5mM)。采用250mL血清瓶液体光照培养将目标菌株培养（7296）h后目测生长情况。4.5硫酸盐同化能力在光合细菌培养基配方中去除出含硫元素成分：（NH4）2SO4、FeSO4。将目标菌株利用该培养基，采用250mL血清瓶液体光照培养72小时，然后将目标菌株接入添加了0.5mmol/L的（NH4）2SO4相同培养基中，采用250mL血清瓶液体光照培养（7296）h后目测生长情况。4.6生长因子目标菌对生长因子需求测定方法，在光合细菌培养基中，不加入原有成分yeastextract，而是分别加入：b，生物素；n，尼克酰胺；t，硫胺素；p-ABA，对氨基苯甲酸，浓度为0.1%的五种
30、培养基。接种目标菌株，厌氧光照培养（7296）h后，观察菌株生长情况。4.7氢气利用配制基础培养基：1000mL蒸馏水中加入2.0g(NH4)2SO4、0.2gMgSO47H2O、0.5gNaH2PO4H2O、0.1gCaCl22H2O、0.5gK2HPO4。培养基中不含碳源。将目标菌株接入到含有250mL基础培养基的500mL锥形瓶中，封口后，往瓶中不断通入二氧化碳与氢气，二氧化碳流速为5mL/min，氢气流速为20mL/min。光照培养7296h后，观察菌株生长情况。4.8二价铁利用主要参考目标菌在FeSO4存在与否的情况下的生长情况。以光合细菌培养基为参照，分别配置含有与不含有FeSO4
31、7H2O两种培养液，采用250mL血清瓶液体光照培养将目标菌株培养（7296）h后目测生长情况。4.9碳源与化合物利用10学兔兔标准下载T/SPPHN001-2023配制基础培养基：1000mL蒸馏水中加入2.0g(NH4)2SO4、0.2gMgSO47H2O、0.5gNaH2PO4H2O、0.1gCaCl22H2O、0.5gK2HPO4。将1.0g被测底物：柠檬酸钠、酒石酸钠、甘露醇、甘油、乙醇、葡萄糖酸盐分别加入到基础培养基中配置成待测培养基。将目标菌株接种到待测培养基中，采用250mL血清瓶液体光照培养将目标菌株培养（7296）h后目测生长情况。4.10G+Cmol%先液体培养目标菌株，
32、将采用细菌DNA提取试剂盒，参照试剂盒使用说明书提取目标菌株菌DNA。取少量样品DNA使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其条带和浓度，并采用NanoDrop2000测定浓度，-20冰箱保存备用。Tm测定：利用带加温装置的紫外分光光度计，波长固定于260nm；将待提取DNA测样品用0.1SSC稀释至OD260值于0.30.6间；在波长260nm首先记录25的吸光度（A25）然后温度迅速上升至50；每隔35记录一次；OD值开始上升表示变性开始，每隔1稳定5min，记录杯内温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕。Tm值计算：（1）热变形温度测定完成后，将记录的温度和相应光密度整理成表；（2）各光密度乘相应
33、温度的相对膨胀系数（Vt）与25时光密度相比Vt/V25，求得相对的光密度；（3）以温度为横坐标，以相对光密度为纵坐标，绘制热变性曲线。热变形曲线中点相对应的温度即为熔链温度（Tm值）。最后按照公式进行G+Cmol%含量计算：0.1SSC：G+Cmol%=2.44Tm-69.31SSC：G+Cmol%=2.08Tm-106.4注：必须以大肠埃希氏菌（E.coliK12）为参比操作对照，以核实实验误差。11学兔兔标准下载T/SPPHN001-2023附录C（规范性）菌种鉴别方法16SrDNA基因序列分析法1样品DNA提取将目标菌株涂布法在双层培养基平板上培养（710）d，挑取红色单菌落，采用细菌
34、DNA提取试剂盒，参照试剂盒使用说明书提取细菌DNA。样品DNA使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其条带和浓度，并采用NanoDrop2000测定浓度，-20冰箱保存备用。2引物16SrDNA序列引物对为：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1429R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。316SrDNAPCR扩增将检测合格的样品DNA作为PCR扩增的模板，采用50L反应体系进行PCR扩增。PCR扩增体系：5L10PCRbuffer(含20mmol/LMgCl2)，4LdNTP，1LPrimerF(上游引物)，1LPrimerR（下游引物），0.3LTaqTMDNA聚
35、合酶，2L模板DNA，ddH2O补足50L。PCR反应条件：95预变性10min，95变性45s，55退火1min，72延伸45s，循环35次;最后72延伸10min，4保持PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应设立3个重复反应管，并用一双蒸水代替模板DNA设立阴性对照管。4PCR产物检测扩增结束后，PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。回收检测结果正确的条带，送公司测序。516SrDNA序列的测定将测序得到的16SrDNA序列提交到NCBI核酸数据库已有的核酸序列进行BLAST程序对比，通过对比找到与NCBI核酸数据库中与嗜硫小红卵菌同源性大于99%相近序列进而确定菌种。12
36、标准学兔兔下载T/SPPHN001-2023附录D（规范性）光合细菌培养基醋酸钠0.5gYeastextract1.5K2HPO41gKH2PO40.6g（NH4）2SO40.5gFeSO47H2O0.05gH3BO40.05g加蒸馏水至1L琼脂1.3g（下层）1.8g（上层）若配双层固体培养基注：根据实际情况将PH值调到7时的用量为准（K2HPO4）有效活菌数测定的选择性培养基乙酸钠1.64gMgSO47H2O0.2gK2HPO40.9gKH2PO40.6gCaCl22H2O0.075gEDTA0.02g（NH4）2SO41.32gFeSO47H2O0.0118g微量元素溶液0.001L加去
37、离子水至1LpH7.0（用三乙胺碱调）微量元素溶液H2BO20.28gMnSO4H2O0.21gNa2MoO42H2O0.075gZnSO47H2O0.24gCuSO45H2O0.004g加去离子水至0.1L霉菌数测定的马丁培养基KH2PO41.0gMgSO47H2O0.5gGlucose10.0g蛋白胨5.0g1%孟加拉红水溶液3.3mL琼脂18g加蒸馏水至1L13阳性管数95%MPN可信限阳性管数95%MPN可信限0.100.010.001下限上限0.100.010.001下限上限0003.0-9.5220214.5420013.00.159.6221288.7940103.00.1511222358.7940116.11.218230298.7940206.21.218231368.7940309.43.638300234.6941003.60.1718301388.71101017.21.3183026417180102113.638310439