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1、学兔兔标准下载ICS65.020.30CCSB41团体标准T/SHZSAQS002152023绵羊毛囊黑色素细胞体外培养技术规程2023-11-27发布2023-11-27实施石河子市质量标准化协会发布学兔兔标准下载T/SHZSAQS002152023目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14工作区条件.15主要仪器设备.16主要试剂.27培养方法.28细胞免疫荧光鉴定.39细胞冻存.310废弃物处理.311人员防护措施.3I学兔兔标准下载T/SHZSAQS002152023前言本文件参照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规则起
2、草。本文件起草单位：新疆农垦科学院畜牧兽医研究所。本文件主要起草人：杨华、周华倩、樊文华、郑晶晶、杨永林、余乾、张文喆。II兔学兔标准下载T/SHZSAQS002152023绵羊毛囊黑色素细胞体外培养技术规程1范围本文件规定了绵羊毛囊绵羊黑色素细胞体外培养的术语与定义及工作区条件、主要仪器设备、主要试剂、培养方法、细胞免疫荧光鉴定方法、细胞冻存、废弃物处理、人员防护措施等。适用于绵羊毛囊黑色素细胞体外培养。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验
3、室生物安全通用要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T31190实验室废弃化学品收集技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1黑色素细胞黑色素细胞是脊椎动物皮肤、毛发着色的主要细胞群，主要存在于表皮基底层，并少量存在于毛囊中。3.2毛囊毛囊是表皮向真皮凹陷后形成的皮肤附属结构，能控制毛发生长及着色，是由胚胎期神经外胚层与中胚层相互影响，发育形成多种细胞群组成的较完整结构。4工作区条件工作区一般包括准备室、缓冲间、无菌室及细胞保存室。工作区日常安全管理应符合GB19489相关要求。5主要仪器设备1兔学兔标准下载筛网过滤消化液，1500rpm离心5min，以1106/c
4、m的密度种植于M-254细胞培养T/SHZSAQS002152023CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、冰箱、恒温水浴箱、高压灭菌器、干燥箱等。6主要试剂6.1如无特别说明，所用试剂均为分析纯。试验用水应符合GB/T6682相关要求。6.2无水乙醇、1PBS、优等胎牛血清、EDTA、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、M-254培养基、HMGS培养基、DMEM（highglucose）培养基。7培养方法7.1样品采集7.1.1采集绵羊背部皮肤，将皮肤剪成0.2cm1cm大小，在含有双抗的1PBS中浸泡5min，1PBS冲洗3次，用0.25%DispaseII于37孵箱内消化1h。7.1.2
5、取出消化后的皮肤组织，1PBS冲洗干净，解剖显微镜下去除表皮和皮下脂肪组织，保留真皮组织。7.2绵羊皮肤中毛囊组织的分离与纯化真皮组织剪成0.2cm0.2cm小块，加入0.1%型胶原酶，37消化3060min，轻轻反复吹打直至吹散真皮组织，70m筛网过滤吹散真皮组织块，1PBS冲洗3次，收集毛囊组织，1500rpm离心5min，最后收集在管底沉淀的毛囊组织。7.3绵羊毛囊黑色素细胞的分离与培养7.3.1向毛囊组织中加入0.25%胰酶（含0.02%EDTA），37培养箱内消化5min，通过显微镜观察毛囊组织周围有细胞团出现时，DMEM+10%胎牛血清终止消化，40m2基中，375%CO2培养箱中
6、培养。7.3.2培养24h后，显微镜观察有两极状贴壁细胞，弃上清，用含有3倍双抗的1PBS轻轻清洗1次，更换新鲜M-254培养基继续培养。7.3.3当细胞长至7080%时，弃上清，用1PBS轻轻冲洗细胞，加入适量含0.02%EDTA的0.05%胰蛋白酶的消化液，显微镜下观察细胞状态，待一半细胞变圆时立即加入含10%胎牛血清的DMEM终止消化。7.3.4用移液枪轻轻吹散细胞，收集细胞悬液于离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，M-254培养基重悬细胞，以1:3的比例接种细胞。2兔学兔标准下载T/SHZSAQS0021520238细胞免疫荧光鉴定8.1毛囊黑色素细胞密度约8090%的时，弃
7、上清，1PBS洗3次，每次5min；将4%多聚甲醛加入细胞培养板中使之充分接触细胞，25条件下固定30min，吸弃全部液体，1PBS洗3次，每次5min。8.2用0.3%TritonX-100通透细胞60min，1PBS清洗3次，每次5min；用1%BSA封闭细胞中的非特异性抗原，25下60min。8.3吸弃全部液体，加入包含MITF、TYR、TRP和PAX蛋白的一抗200L于4冰箱中过夜；次日吸弃全部一抗液体，用1PBS洗3次，每次5min。8.4加二抗于细胞中，25下避光孵育60min；吸弃全部二抗液体，用1PBS洗3次，每次5min。8.5避光下将Hoechst33342染液加入细胞培养
8、板中，作用10min；1PBS洗3次，每次5min，通过显微镜观察，采集图像并分析，激发出荧光说明该细胞为毛囊黑色素细胞。9细胞冻存9.1在细胞融合前，将细胞同培养液一起吸出，放入离心管中。9.2往培养皿中加入1mL胰蛋白酶进行消化，混匀5次，1000r/min离心5min，吸出含酶的上清悬液。9.3将细胞用1.5mL培养液再次悬浮，1000r/min离心5min，再用1mL冻存液重新悬浮细胞。加入适量冻存液。9.4将1mL冻存液悬浮的细胞移至1.5mL离心管中，放入冻存盒中于4冰箱2h，取出放入-20冰箱过夜，次日将其移至-80冰箱内，最后投入液氮罐中长期保存。10废弃物处理试验实施过程中，产生的血液等废弃物应经过高温高压灭菌或采取其它方式灭菌；有毒有害废弃物应存放于密闭容器中。废弃物的处理应符合GB/T31190相关要求。11人员防护措施试验中，人员安全防护和防止交叉污染措施应符合GB19489相关要求。-3