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1、肠道腹泻传染病实验室检测 概述概述以腹泻症状为主的以腹泻症状为主的肠道传染病肠道传染病 霍乱 伤寒、副伤寒 细菌性痢疾 其他感染性腹泻其他感染性腹泻 除霍乱、痢疾、伤寒、副伤寒以外的感染性腹泻病毒性腹泻：诺如病毒、轮状病毒感染性腹泻，以及星状病毒、肠道腺病毒、札如病毒细菌性腹泻实验室检测细菌性腹泻实验室检测标本采集：粪便/呕吐物/肛拭：12 g，置于干净且无抗生素的容器或APW增菌运送；第二类A包装，UN 2814包装运输腹泻-霍乱弧菌快速辅助诊断快速辅助诊断(PCR-ctx(PCR-ctx、免疫荧光、金标、免疫荧光、金标)标本（粪便、肛拭子、呕吐物，水体、水生动物等）标本（粪便、肛拭子、呕吐
2、物，水体、水生动物等）增菌培养（碱胨水）增菌培养（碱胨水）3737、68h68h选择性培养基分离培养选择性培养基分离培养挑挑取取5 5个个以以上上可可以以菌菌落落接接种种非非选选择择性性培培养养基基3737、1218h1218h纯纯培培养，同时可进行养，同时可进行O1/O139O1/O139群霍乱弧菌排查（玻片凝集试验）群霍乱弧菌排查（玻片凝集试验）二次增菌（碱胨水）二次增菌（碱胨水）初步报告结果初步报告结果（采取相应防治措施）（采取相应防治措施）阳性阳性阴性不应排除阴性不应排除发现发现O1/O139O1/O139群凝集试验阳性（结合形态观察等）群凝集试验阳性（结合形态观察等）O1/O139O
3、1/O139群凝集试验阴性，按需要群凝集试验阴性，按需要对纯培养物进行弧菌属种鉴定对纯培养物进行弧菌属种鉴定系统的鉴定与分型系统的鉴定与分型（生化特征、噬菌体（生化特征、噬菌体-生物分型、分子生物学等）生物分型、分子生物学等）以纯培养物进行以纯培养物进行O1O1群血清学分型、群血清学分型、O139O139群血清学复核、群血清学复核、粘丝试验、氧化酶试验、克氏双糖（粘丝试验、氧化酶试验、克氏双糖（KIAKIA）等）等报告报告O1/O139O1/O139群结果群结果（保存阳性及可疑菌株上送）（保存阳性及可疑菌株上送）标本采集：粪便/呕吐物/肛拭：12 g，置于干净且无抗生素的容器或盐胨水增菌室温运
4、送；同时采集疑似食品/食物样本按第三类B包装，UN3373包装运输，一般采用半固体进行菌株的运输，不能使用低温和冷链进行运输。室温情况下（20 ），普通平板/斜面上可以存活1个星期以上；半固体中至少可以保存0.5-1年，可以作为短期保存或运输。（无论是半固体、普通平板还是斜面中的副溶血弧菌均不能置于2-8度的冰箱中，那样会导致其死亡）使用磁珠管或甘油管，将大量菌苔充分悬浊于冻存液，-80冻存，可保存5-10年（不能置于-20 冰箱中保存）腹泻-副溶血弧菌标本采集：血液：足量（8-10ml），第1-2周，只要发热未退，两周以后仍可获得阳性结果。骨髓：1-3ml粪便：第2-3周 2-3 g，置于干
5、净且无抗生素的容器或保存于（Carry-Blair）运送培养基内4小时内送检；不能及时送检的，保存于4，且于24小时内送检。其他体液标本：胆囊炎或胆结石-胆汁、脓肿-脓液菌株运输：第三类B包装，UN3373包装运输菌株保存：平板/斜面/半固体/磁珠管/牛奶管/甘油管腹泻-伤寒及副伤寒标本采集：粪便：12 g，置于干净且无抗生素的容器或保存于（Carry-Blair）运送培养基内4小时内送检；不能及时送检的，保存于4，且于24小时内送检。肠外感染：败血症-血液培养（同伤寒副伤寒）、脓肿-脓液菌株运输：第三类B包装，UN3373包装运输菌株保存：平板/斜面/半固体/磁珠管/牛奶管/甘油管腹泻-非伤
6、寒沙门菌Carry-Blair运送培养基采集保存粪便标本SBG增菌培养基中361增菌16小时接种科玛嘉沙门菌显色培养基或SS培养基挑取紫色、淡紫色菌落（科玛嘉）或无色透明、中心黑色菌落（SS）3-5个转种KIA、MIU选K/A，产气+，H2S+-，动力+，靛基质-，尿素-菌落进行ONPG鉴定试验符合菌落接种于哥伦比亚琼脂平板（“O”）和软琼脂平板（“H”）做O多价、O因子及H相血清学诊断，于Swarm Agar琼脂平板进行相应“H 2相”诱导做H2相血清诊断，凝集阴性再次进行诱导或U型管诱导血清凝集结果报告菌株保存腹泻-弯曲菌标本采集：粪便：发病3-5病日内采集、最好是在使用抗生素之前采集，采
7、集粪便样本要尽量避免污染，样本尽量避免接触氧气。冷藏运输，尽早检测（室温运输须在2h-6h内进行检测）菌株运输：第三类B包装，UN3373包装运输菌株保存：磁珠管/牛奶管/甘油管/保鲜运输培养基空肠弯曲菌在弯曲菌保鲜运输培养基内可存活4周以上，可以作为短期保存或运输。在20%甘油的脑心浸液培养基内至少可以保存1年以上，在弯曲菌低温保存培养液中可保存10年以上。腹泻-志贺菌标本采集：粪便：志贺菌的抵抗力比其他肠道杆菌弱，粪便标本应尽快送检，不得超过 2 h 送到化验室，否则标本应放入 Cary-Blair 运送培养基中，运送时间超过 2h 者，应在冰浴条件下送检（可保存13 天）。菌株运输：第三
8、类B包装，UN3373包装运输菌株保存：平板/斜面/半固体/磁珠管/牛奶管/甘油管腹泻-致泻大肠杆菌标本采集：要求在发病早期（5天之内)、使用抗生素治疗前采集，标本要新鲜，以采集腹泻病人的血性便为主，水样便约1-3ml，成形便约1g，置于Cary-Blair运送培养基或1:10接种mEC增菌肉汤直接送检。标本应于2小时内送往实验室，最迟不能超过6小时。菌株运输：第三类B包装，UN3373包装运输菌株保存：平板/斜面/半固体/磁珠管/牛奶管/甘油管吸取1.5mL增菌液，离心集菌，快速裂解液重悬细菌，制备DNA模板与mEC增菌液按照适当比例混合多重PCR扩增接种于致病性大肠杆菌选择性培养基多重PC
9、R扩增阳性菌落革兰染色为G-杆菌Api 20E系统生化鉴定，血清型鉴定确定菌株是否为致泻性大肠杆菌以及致病型挑选5-10个可疑菌落采集新鲜标本37培养过夜纯培养腹泻-单增李斯特菌标本采集：主要以粪便标本为主；对败血症和脑膜炎病人应采集血液和脑脊液标本；围产期感染采集胎盘拭子（母面及子面）、新生儿分泌物、血液（败血症）或脑脊液（脑膜炎）。菌株运输：第三类B包装，UN3373包装运输菌株保存：平板/斜面/半固体/磁珠管/牛奶管/甘油管腹泻-小肠结肠炎耶尔森菌标本采集：以粪便标本为主，对败血症病人应采集血液标本病人的粪便标本需要在发病3-5病日内采集、最好是在使用抗生素之前采集。菌株运输：第三类B包
10、装，UN3373包装运输菌株保存：平板/斜面/半固体/磁珠管/牛奶管/甘油管直接接种于耶尔森菌选择性平板与改良PBS增菌液1:10混合4冷增菌1020天25培养48小时选择形态可疑菌落（“公牛眼”状）接种于改良克氏双糖或三糖铁培养基改良克氏双糖斜面：黄/黄 不产H2S 不产气或少量产气气或少量产气三糖铁斜面：红/黄 或 黄/黄25培养24小时25培养25培养24小时分解尿素者分别接种于2管半固体培养基37培养24小时动力（-）动力（+）动力（-）动力（+）且革兰染色G-杆菌或球杆菌Api20E系统生化鉴定确定菌株接种于尿素培养基采集新鲜标本病毒性腹泻实验室检测病毒性腹泻实验室检测病毒性腹泻实验
11、室检测病毒性腹泻实验室检测l病毒性腹泻是由病毒感染引起的急性肠道传染病l以恶心、呕吐、腹痛、腹泻（排水样便或稀便）为主要临床症状l主要病原体：轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒、肠道腺病毒病毒性腹泻病毒性腹泻1.病例定义（1）疑似病例：每日排便3 次，伴有大便性状改变（呈稀 便、水样便等）；和/或 24 小时内出现呕吐2 次。（2）临床诊断病例：满足疑似病例定义，与实验室确诊病 例有流行病学关联的病例。（3）实验室确诊病例：从粪便、肛拭子或呕吐物等标本检 出诺如病毒等病毒性腹泻病原的疑似病例或临床诊断病例。1、标本采集：根据 现场调查线索应采集不同类型的标本，包括病例、密切接触者、与餐饮接
12、触等人员的粪便、肛拭子和呕吐物，以及可疑的水、食 品或其它环境标本。粪便首选粪便标本。每份标本 5g 或 5mL 以上，直接放置于清洁、无菌、干燥的密闭容器内。容器内不可加入任何保护剂、培养基、去污剂或金属离子，不可稀释。肛拭子肛拭子标本不能长期保存，且检出率低于粪便标本。肛拭子含粪便量很低时，如检测结果呈弱阳性，结果容易被误判，导致假阴性。采集时需注意肛拭子上应有可见的粪便，放入无菌带盖密闭采样管。采样管中应有 2mL 无菌 PBS 缓冲液或 Hanks 液，液体需没过肛拭子棉签部分，并尽快检验。呕吐物呕吐物每份标本采集 5g 或 5mL 以上，直接放置于清洁、无菌、干燥的密闭容器内。容器内
13、不可加入任何保护剂、培养基、去污剂或金属离子，不可稀释病毒性腹泻实验室检测病毒性腹泻实验室检测水目前没有水样品采集量的权威规定。怀疑水源性暴发时，建议尽量采集 1 升以上的水样品。桶装水、瓶装水等直接采集原包装，自来水需要以无菌容器采集。需经过浓缩后检验，有助于提高检出率。食品由于食品成分复杂、病毒含量不高，从食品样品中提取诺如病毒 RNA 的回收率受限。食品样品应置于无菌容器中，立即 4冷藏，当天运至实验室进行检验。环境涂抹样根据疫情调查需要采集疫情发生机构相关场所如厨房、厕所、门把手、玩具等环境涂抹样品。可用无菌拭子在无菌 PBS 里蘸湿，用力涂抹待采表面（最大面积 100cm2）后，立即
14、浸入核酸提取试剂盒裂解缓冲液中或应有 2mL 无菌 PBS 缓冲液或 Hanks 液标本检测标本检测标本处理标本处理粪便、呕吐物（1）离心管每管分装 0.5mLPBS。用一次性移液管（或无菌棒）添加豌豆大小的粪便（约 0.1 克），稀释成约 10至 20（重量/体积）的粪便悬浮液。当粪便样品是液态时，不必在 PBS 中稀释，直接使用 500L 的样品。（2）漩涡振荡每个样品 1 分钟。在 5000 rpm 下离心 5 分钟，使得固体沉淀。澄清上清液可以直接用于病毒核酸提取或贮存于70。（3）取澄清的上清液 200L 进行 RNA 提取。标本处理标本处理水通过阴离子滤膜过滤水样品，使用专业过滤装
15、置进行，为防止气溶胶的污染，应在无菌的环境中过滤，在生物安全柜进行操作 环境涂抹样将棉签用力压采样管的侧壁，释放棉签中的液体。重复浸入和压侧壁的步骤34次，确保病毒最大释放量，直接进入核酸提取步骤。水水、环境、食品和呕吐物等标本的检测前处理和核酸提取，、环境、食品和呕吐物等标本的检测前处理和核酸提取，参考参考诺如病毒诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南（感染暴发调查和预防控制技术指南（2015 2015 版）版）相关相关内容内容核酸提取各类样品经前处理后，每个样品分别取200L，按照核酸提取试剂盒说明书操作提取RNA。核酸检测方法 Realtime（TaqMan）RTPCR 方法可以采用商品
16、化试剂盒进行检测3、标本保存和运输标本在 4冰箱可暂存 12 小时，之后标本应放置20以下冷冻保存，需长期保存的标本应储存在70冰箱，避免反复冻融。依据人间传染的病原微生物名录，含病毒性腹泻病原体的标本属于 B 类包装分类，需按照 UN3373 规定进行包装和手续申报，并在冷藏或冷冻条件下运送。对于短途运输（1 天以内），包装盒内放冰袋或冰排，长途运输（12 天）需用干冰。但无论短途或长途运输，均需保证冻存标本在运输过程没有出现融化。标本送达实验室时应包装完整，不得泄露，包装盒内应有未融化的冰。在运输中应避免强烈震动、重力挤压等现象。标本保存和运送的条件应有详细记录。病毒性腹泻暴发疫情病毒性腹
17、泻暴发疫情根据全国病毒性腹泻监测方案（2021 版）诺如病毒等病毒性腹泻暴发疫情进行实验室监测：1、完成暴发疫情样本数采集，以及信息录入,每起疫情至少收集 20 份标本2、及时开展诺如病毒等5种病毒性腹泻病原体实验室检测3、样本完成检测后，对纳入的重点疫情填写全国病毒性腹泻监测方案（2021 版）的附件 11诺如病毒等聚集性/暴发疫情信息汇总一览表和附件 12诺如病毒等聚集性/暴 发疫情标本送检单，并上报省疾控中心实验室4、同时上送病毒性腹泻疫情的阳性样本至省疾控中心实验室试剂储备试剂储备-病毒类检测病毒类检测各市（州）、县疾控中心1、做好病毒性腹泻5种病原体（RV/NV/ADV/AstV/SV）的核酸提取试剂以及荧光PCR检测试剂的储备2、开展病毒性腹泻疫情病原体检测3、及时上报实验室检测信息，并上送阳性样本至省疾控中心 试剂试剂储备储备-细菌类检测细菌类检测必备采样用试剂耗材必备霍乱O1和O139血清及快检试剂，市级必备毒力基因检测试剂必备伤寒副伤寒肥达氏检测试剂和常见沙门菌血清诊断试剂必备常见细菌分离培养用培养基：TCBS/APW/XLD/BPW/EMB/MAC/SS/金葡和弧菌显色必备生化鉴定试剂市级必备多病原细菌检测试剂盒，常见药物药敏试剂谢谢 谢！谢！