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1、学兔兔标准下载ICS687.050CCSX04中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T57422023鱼类及其制品中金枪鱼、鳕鱼和虹鳟鱼成分快速检测方法PCR试纸条法RapiddetectionofThunnus,GadusandOncorhynchusmykissingredientinfishandfishproductsPCRLateralflowdipstickmethod2023-12-29发布2024-07-01实施中华人民共和国海关总署发布学兔标准兔下载学兔兔标准下载SN/T57422023前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则
2、的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国天津海关、天津师范大学、韶关学院（广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室）、青海大学。本文件主要起草人：赵良娟、王飞、杨爽、郑文杰、张霞、李长忠、季超、金文杰、刘金玉。I学兔标准兔下载学兔兔标准下载SN/T57422023鱼类及其制品中金枪鱼、鳕鱼和虹鳟鱼成分快速检测方法PCR试纸条法1范围本文件描述了鱼类及其制品中金枪鱼成分、鳕鱼成分、虹鳟鱼成分检测的PCR试纸条方法。本文件适用于蓝鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大眼金枪鱼、太平洋鳕
3、鱼、大西洋鳕鱼、黑线鳕鱼、狭鳕、虹鳟及其制品中金枪鱼成分、鳕鱼成分、虹鳟鱼成分的PCR试纸条定性检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T35918动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法3术语和定义下列术语和定义适应于本文件。3.1金枪鱼Thunnus属于鲈形目（Perciformes），鲭科（Scombri
4、dae）大型远洋性重要商品食用鱼的统称。注1：见于世界暖水海域，与鲭、鲐、马鲛等近缘，通常同隶鲭科。常见被称为金枪鱼的商品鱼类有蓝鳍金枪鱼（Thunnusthynnus）、长鳍金枪鱼（Thunnusalalunga）、黄鳍金枪鱼（Thunnusalbacares）、大眼金枪鱼（Thunnusobesus）。注2：本文件中金枪鱼成分即指金枪鱼特异性DNA片段。3.2鳕鱼Gadus鳕形目（Gadiformes）鱼类，主要指鳕科（Gadidae）和无须鳕科（Merlucclidae）的鱼类。注：本文件中鳕鱼成分即指鳕鱼特异性DNA片段。3.3虹鳟Oncorhynchusmykiss鲑形目鱼类，鲑科、
5、太平洋鲑属的一种鲑鱼。注：本文件中虹鳟鱼成分即指虹鳟鱼特异性DNA片段。1物种名称引物序列（53）5端标记物靶基因金枪鱼F：5TGGTATCAGGCACACCCAA-3异硫氰酸盐12srRNAR：5CGCCGGTGTCTGTCAACTT-3生物素鳕鱼F：5TCTAGGCCTTTGCTTAATTACT-3异硫氰酸盐CYTBR：5CCTACGAAAGAGGTTATTATTACT-3生物素虹鳟F：5GTCCCACTGTGGCTTGCT-3异硫氰酸盐ATP6R：5GGGTTCCTTCAGGCAATAA-3生物素兔标准学兔下载SN/T574220234缩略语下列缩略语适应于本文件。CTAB：十六烷基三甲
6、基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）。dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）。EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）。FITC：异硫氰酸盐（Fluorescein5-isothiocyanate）。Tris：三羟甲基氨基甲烷Tris（Hydroxymethyl）aminomethane。5方法原理利用裂解液破碎样本细胞，苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，以提取的DNA为模板，采用上游和下游引物分别经异硫氰酸
7、盐和生物素标记进行PCR扩增，获得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的PCR产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对PCR产物进行筛选检测，并对PCR阳性产物进行测序确证。6试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。6.1检测用引物（对）序列及标记物检测用引物（对）序列及标记物详见表1。表1引物（对）序列及标记物6.2试剂6.2.1ExTaqHotStartDNA聚合酶。6.2.2dNTPs：dATP（脱氧腺苷三磷酸）、dTTP（脱氧胸苷三磷酸）、dCTP（脱氧胞苷三磷酸）、dGTP（脱氧鸟苷三磷酸）。6.2
8、.3三氯甲烷（氯仿）。6.2.4异丙醇。2学兔兔标准下载SN/T574220236.2.5CTAB提取液：称取4.0gCTAB，16.364gNaCl，加入20mL1mol/LTris-HCl溶液，8mL500mmol/LNa2-EDTA溶液，先用70mL双蒸水溶解，再定容至200mL，在103.4kPa（121）条件下灭菌20min。6.2.6CTAB沉淀液：称取1.0gCTAB，0.467gNaCl，先用70mL双蒸水溶解，再定容至200mL，在103.4kPa（121）条件下灭菌20min。6.2.725：24：1酚/三氯甲烷/异戊醇溶液。6.2.824：1三氯甲烷/异戊醇溶液。6.2.
9、9氯化钠溶液（1.2mol/L）：在200mL双蒸水中加入35.05g氯化钠（NaCl），溶解后再加双蒸水定容至500mL。6.2.10氢氧化钠溶液（1mol/L）：在160mL双蒸水中加入8g氯化钠（NaOH），溶解后再加双蒸水定容至200mL。6.2.11Tris-HCl溶液（1mol/L）：称取121.1gTris溶解于800mL双蒸水中，用HCL调pH至8.0，加双蒸水定容至1000mL。在103.4kPa（121）条件下灭菌20min。6.2.12蛋白酶K（670U/mL）：称取0.10g酶活为33.5U/mg（Unit，酶学单位）的蛋白酶K干粉，加入5mL双蒸水，轻轻摇动，直至蛋白
10、酶K完全溶解，分装成小份贮存于-20。6.2.13试纸条：含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条，可通过采购的原料试剂自行组装（见附录A）或采用等效的商品化试纸条。6.2.14展开液：取2L1mol/LTris-HCl溶液，200L10mg/mLBSA，2mLTween-20，10mL1mol/LNaOH溶液，定容至200mL，涡旋混合均匀；或采用等效的商品化产品。7仪器设备7.1离心机（离心力12000g），41。7.2微量移液器（100L1000L，20L200L，2L20L，0.5L10L）。7.3PCR仪。7.4恒温水浴锅，651。7.5天平：感量0
11、.01g7.6pH计。7.7核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。8检验步骤8.1样品前处理鲜活成鱼宜取肌肉组织。如需非致死性取样，剪取部分鱼鳍条或者刮去部分皮肤后取皮下一小块3mm35mm3的肌肉块即可。其他鱼类制品，例如罐头、寿司等，宜取肌肉组织部分，少有脂肪组织。将固状待检样品研磨混匀，分装3份，其中1份为检样，另外2份为留存样品。加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式尽量去除样品中的盐、糖和色素等杂质。3试剂体积2+10PCR缓冲液（含20mmol/LMg）2.0L正向引物（5mol/L）0.8L反向引物（5mol/L）0.8LExTaqH
12、otStart（5U/uL）0.2LDNA模板（4ng/L）1.0LdNTP（2.5mMeach）2.0L灭菌ddH2O13.2L学兔兔标准下载SN/T574220238.2样品DNA提取称取100mg样品于2mL离心管中，加入1mLCTAB提取液，加入10L20mg/mL蛋白酶K，65温育1h，期间不时振荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量CTAB提取缓冲液；取出后12000g离心10min，转移上清至2mL离心管中，加入等体积的室温酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）颠倒混匀，12000g转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（2
13、4：1），颠倒混匀，室温下12000g离心10min；转移上清至干净离心管中，加入等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h；加入0.8倍体积的异丙醇或2倍体积-20冰箱中预冷的无水乙醇混匀，-20放置30min，12000g4离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4离心10min，弃上清，室温下晾干。加入50L双蒸水，室温10min，混匀，-20保存。也可按照GB/T35918的方法提取，或使用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。8.3DNA浓度和纯度的测定取5LDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A
14、260和A280。DNA的浓度按公式（1）计算：c=AN50/1000（1）式中：cDNA浓度，单位为微克每微升（g/L）；A260nm处的吸光值；N核酸稀释倍数。当A260/A280比值在1.71.9之间时，适宜于PCR扩增。8.4PCR扩增8.4.1PCR反应体系PCR反应体系见表2。表2PCR反应体系8.4.2PCR反应条件PCR反应条件见表3，PCR反应条件随不同的PCR仪略有改变。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用含目标成分的样品作阳性对照，用不4物种成分反应条件金枪鱼95预变性5min；95变性10s，56退火30s，72延伸20s，30个循环后进入725min鳕鱼9
15、5预变性5min；95变性10s，55退火30s，72延伸30s，30个循环后进入725min虹鳟鱼95预变性5min；95变性10s，58退火30s，72延伸20s，30个循环后进入725min学兔兔标准下载SN/T57422023含目标成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。表3PCR反应条件8.4.3试纸条检测取5LPCR产物点于核酸试纸条样品垫，再加入95L展开液后进行检测，5min后观察结果。9质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a）空白对照：质控线变红，检测线未变红。b）阴性对照：质控线变红，检测线未变红。c）阳性对照：质控线变红，检测线变红。10
16、结果判断与报告10.1结果判定试纸条质控线变红色，且检测线变红色，PCR扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物进行测序确证（序列见附录B）。试纸条质控线变红色，检测线不变色，PCR扩增产物为阴性。10.2结果报告PCR产物试纸条检测为可疑阳性，同时序列相似度最高且大于98%者，判为含有XXX（目标物种）成分，结果报告为检出XXX（目标物种）成分。PCR产物试纸条检测为阴性，判为不含有XXX（目标物种）成分，结果报告为未检出XXX（目标物种）成分。11检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T274032008中附录D的规定执行。12检出限本文件所规定方法的最低检出限（LO
17、D）为0.1%（质量分数）。5学兔兔标准下载SN/T57422023附录A（资料性）含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条A.1组成成分A.1.1抗FITC抗体单克隆抗体或多克隆抗体：a）单克隆抗体：Anti-FITCantibody鼠单克隆抗体；b）多克隆抗体：Anti-Fluorescein兔多克隆抗体。A.1.2质控线上的二抗：依据上述兔多抗或鼠单抗方案可分别选择羊抗兔或者羊抗鼠抗体。A.1.3链亲和素：重组链亲和素，大肠杆菌表达的重组Streptavidin蛋白。A.2试纸条结构试纸条结构见图A.1。标引序号说明：1吸水滤纸垫；2结合物垫，附有FIT
18、C抗体（兔源）与胶体金颗粒的交联体；3侧向层析基质（硝酸纤维素膜）；4检测带，附有链亲和素；5质控带，附有可结合兔源抗体的抗体；6衬底；7吸水垫。图A.1试纸条结构图A.3试纸条检测原理检测用试纸条的吸水垫上含有金标记的抗异硫氰酸盐（FITC）的兔多克隆抗体，可与PCR产物一条链上的FAM标记分子结合，在检测线位置上固定有链亲和素，可与PCR产物另一条链上的生物素结合。阳性PCR扩增产物在展开液的作用下，首先与金标记的羧基荧光素抗体结合，通过虹吸作用向上部移动，在经过固定有链亲和素的检测线位置时，因带有生物素标记而被链亲和素捕获在该位置上，显示棕红色，过量的产物继续向上移动至固定有羊抗兔抗体的
19、质控线位置，因其带有抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体而被捕获在质控线上，从而显示出两条色带。非特异性扩增的PCR产物因无生物素或异硫氰酸盐标记的缘故，不能与金标记的异硫氰酸盐抗体结合，且被链亲和素捕获，从而不能在检测线位置显示颜色，而未参与反应的PCR引物因带有异硫氰酸盐标记，故也可被异硫氰酸盐抗体捕获向上一直移动至质控线被羊抗兔抗体捕获而显色。6学兔兔标准下载SN/T57422023附录B（资料性）基因扩增靶标参考序列B.1金枪鱼成分的基因扩增靶标参考序列（gennbank号：X97337.1）TGGTATCAGGCACACCCAACKAAAGCCCATGACGCCTTGCTTAGCCACACCC
20、TCAAGGGAACTCAGCAGTGATAAACCTTAAGCTATAAGTGAAAACTTGACTTAGTTAAAGCTAAGAGGGCCGGTAAAACTCGTGCCAGCCACCGCGGTTATACGAGAGGCCCAAGTTGACAGACACCGGCGB.2鳕鱼成分的基因扩增靶标参考序列（gennbank号：NC_002081.1）TCTAGGCCTTTGCTTAATTACTCAACTTCTAACAGGACTATTTCTAGCCATACACTATACCTCAGACATCGAGACAGCCTTCTCATCCGTAGTCCACATCTGTCGTGATGTAAACTACGGCTGACTAATTCGGAATATACATGCTAATGGTGCCTCTTTCTTTTTCATTTGTCTTTATATGCACATTGCCCGAGGTCTCTATTATGGTTCCTATCTTTTTGTAGAGACATGAAACATCGGGGTTGTCCTTTTCCTTTTAGTAATAATAACCTCTTTCGTAGGB.3虹鳟鱼成分的基因扩增靶标参考序列（gennbank号：NC_001717.1）GTCCCACTGTGGCTTGCTACAGTAATTATCGGCATACGAAACCAGCCTACGGCCGCCCTCGGCCATTTATTGCCTGAAGGAACCC注：阴影部分为上下游引物序列。