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1、ICS07.080A04DB5132四川省（阿坝藏族羌族自治州）地方标准DB5132/T882023牦牛肉PCR膜芯片技术检验方法IdentificationofYakMeatwithPCR-membraneChipTechnology2023-10-26发布2023-12-25实施阿坝藏族羌族自治州市场监督管理局发布DB5132/T882023目次前言.II引言.III1范围.12规范性引用文件.13术语和定义、缩略语.13.1术语和定义.13.2缩略语.14原理.25设备与材料.26主要试剂.27实验用水.28检验步骤.28.1PCR引物及探针.28.2样品处理与DNA提取.38.3多重P
2、CR反应体系.48.4膜芯片制备.48.5杂交显色.48.6结果判读.59结果表述.510生物安全及检测过程中防止交叉污染的措施.5参考文献.7IDB5132/T882023前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由阿坝藏族羌族自治州农业农村局提出并归口。本文件起草单位：四川省龙日种畜场、西南民族大学、成都产品质量检验研究院有限责任公司、成都鸿宜瑞信息技术咨询有限公司。本文件主要起草人：何明珠、江明锋、史贇学、赵睿骁、蒲华荣。IIDB5132/T8820
3、23引言本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时，可能涉及到专利号为ZL201910400450.2一种牦牛肉鉴定试剂盒相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构承诺。他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得:专利持有人姓名:江明锋(西南民族大学),文勇立(西南民族大学),王誉(西南民族大学)。请注意：除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。IIIDB5132/T882023
4、牦牛肉PCR-膜芯片技术检验方法1范围本文件规定了牦牛肉动物源性成分的PCR-膜芯片技术检测方法。本文件适用于水牛、黄牛、猪、羊、鸡、兔、鸭、狗、牦牛肉及其制品的动物源性成分检测，检出限为1%。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T34796水溶液中核酸的浓度和纯度检测3术语和定义、缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1聚合酶链式反应p
5、olymerasechainreaction；PCR在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。3.1.2多重聚合酶链式反应multiplexPCR在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。3.1.3膜芯片技术membraneChipTechnology将预先制备的DNA探针有序的固定于尼龙膜表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。3.2缩略语PCR：polymerasechainreaction；聚合酶链式
6、反应DNA：DeoxyriboNucleicAcid；脱氧核糖核苷酸SSC：SalineSodiumCitratebuffer；杂交印记缓冲液PCRMasterBuffer：PCR缓冲液dNTP：deoxy-ribonucleosidetriphosphate；脱氧核糖核苷三磷酸TaqPolymerase：Thermusaquaticus聚合酶1DB5132/T882023SSPE：核酸杂交缓冲液Mix：PCR的预混物，含有Taq酶、dNTP混合物、MgCl2及优化的缓冲体系ddH2O：双重蒸馏水4原理针对牦牛肉及市场常见假冒牦牛肉动物源性成分特异基因片段设计引物，对DNA模板进行多重聚合酶链
7、式反应扩增，扩增产物与固定有目标基因特异性探针的膜芯片进行杂交，经化学显色后可在杂交点上形成肉眼可见的杂交信号。5设备与材料除实验室灭菌及常规设备外，其他设备和材料如下：5.1pH计（0.01级）5.2天平（感量0.1g）5.3PCR仪5.4生物安全柜5.5膜芯片杂交仪（MFS-8)5.6尼龙转印膜（厚度6mm孔径0.45m负电荷）6主要试剂6.1动物组织基因组DNA提取试剂盒。6.215SSC缓冲液。6.3去活化液（100mmol/L，NaOH）。6.4去活化清洗液（2SSPE，0.1%SDS）。6.5杂交清洗液（2SSPE，0.5%SDS）。6.6孵育液（碱性磷酸酶标记的链霉亲和素按120
8、00的比例加入孵育液中）。6.7孵育清洗液1（2SSPE，0.5%SDS）。6.8孵育清洗液2（0.3mol/LNaCl、20mmol/LNaH2PO4、20mmol/EDTANa2，其pH为7.4）。6.9显色液（BCIP/NBT、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰）。6.10PCR引物及探针（引物浓度20mol/L、探针浓度5mol/L）。6.11PCRMasterBuffer（100mmol/LTris-HCl，15mmol/LMgCl2，pH=8.0）。6.12dNTPs（100mol/L）。6.13TaqPolymerase（0.05U/L）。7实验用水实验用水符合GB/
9、T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法中一级水的要求。8检验步骤2物种目的基因引物/探针序列（5-3）内参actin基因F：5-GAGCGCAAGTACTCTGTGTGGAT-3R：5-biotin-AGAAGCATTTGCGGTGGACG-3探针:5-AminolinkerC6-TCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCA-GCAAGCAGGAGTA-3猪COXI基因F：5-GCTTCATCTTCCTATTCACCGT-3R：5-biotin-GTAATACAATGTCTAGGGAG-3探针：5-AminolinkerC6-TCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAG
10、CAAGCAGGAGTA-3山羊cytb基因F：5-TATGCATGTAGGACGAGGCCTATA-3R：5-biotin-ATTCATTCGACTAGGTTTGTGCC-3探针：5-AminolinkerC6-TACCATGAGGACAAATATCATT-3黄牛12SrRNAF：5-GTGACAAAAATTAAGCCATAAACGA-3R：5-biotin-TCATGGCTTTTTACAGCTTGGT-3探针：5-AminolinkerC6-AAAGCACCATACCAAATAGGGT-3水牛12SrRNAF：5-GTGACAAAAATTAAGCCATAAACGA-3R：5-biotin-
11、GCTGTTATAGAGTCACTTTCGTTGC-3探针：5-AminolinkerC6-AAGCACACCGCTAAATAGAGTTA-3牦牛12SrRNAF：5-GATACCCCACTATGCTTAGCC-3R：5-biotin-ATTTCATAATAACTTTCGTGCA-3探针：5-AminolinkerC6-TACACTAAGAGAACCAATGCA-3鸭12SrRNAF：5-GATACCCCACTATGCTTAGCC-3R：5-biotin-AAGGGGCGGTTGGGTTG-3探针：5-AminolinkerC6-CCTGTTCTGTAATCGACGATCCACG-3狗12Sr
12、RNAF：5-GATACCCCACTATGCTTAGCC-3R：5-biotin-ACATTCGTGAAATGTTCTTGG-3探针：5-AminolinkerC6-GTAACTTATGAGGTGGGAAGAA-3兔12SrRNAF：5-GATACCCCACTATGCTTAGCC-3R：5-biotin-ACCTAACGTTTTTACGGTGG-3探针：5-AminolinkerC6-AACCCTACCACTCTTTGCCAACTCAGCC-3鸡12SrRNAF：5-GATACCCCACTATGCTTAGCC-3R：5-biotin-GCTATTGAGCTCACTGTTGTT-3探针：5-Am
13、inolinkerC6-CCAGCACAGCCTACATACCGC-3DB5132/T8820238.1PCR引物及探针引物和探针序列见表1。表1PCR引物信息3DB5132/T8820238.2样品处理与DNA提取抽取牦牛鲜肉（牦牛肉制品）经制备后，使用动物组织基因组DNA提取试剂盒提取并纯化DNA。8.2.1DNA浓度按GB/T34796水溶液中核酸的浓度和纯度检测规定的方法进行，DNA的浓度10%。8.3多重PCR反应体系以8.2中提取并纯化后的DNA为模板，在20L体系中加入Mix酶10L、正向引物（20mol/L）0.5L、反向引物（20mol/L）0.5L、模板DNA100ng、d
14、dH2O8L，按以下条件进行扩增：95预变性10min；94变性30s、60退火15s、72延伸15s、33个循环；72延伸3min。得到扩增产物。8.4膜芯片制备将尼龙转印膜制备成1.2cm1.8cm的膜条，将裁好的尼龙膜放置于双蒸水中浸泡15min，再用15SSC浸泡15min，取出放在滤纸上60烘干，待尼龙膜降温至室温，按顺序加入内参探针（5mol/L）、检测探针（5mol/L）、阳性探针PC（5mol/L）以及阴性探针NC（5mol/L）（图1）。图1芯片点样模式图8.5杂交显色1)PCR产物变性：PCR产物955min使其解链，放置冰上备用。2)将PCR变形产物加入膜芯片杂交仪中,并
15、开始杂交程序。3)膜芯片去活化：将制备好的膜芯片放入杂交盒内，芯片标签正面朝上，加入1mL去活化液37孵育8min。4)洗膜：加入1mL去活化清洗液60洗脱5min。5)杂交：将变性后的PCR产物与1mL杂交液充分混匀，放入水平摇床45，90r/min孵育45min。4程序名称试剂名称温度/时间/min去活化去活化液378去活化清洗去活化清洗液605杂交杂交液4545杂交清洗杂交清洗液525杂交清洗杂交清洗液525酶孵育孵育液4230孵育清洗1孵育清洗液1425孵育清洗1孵育清洗液1425孵育清洗2孵育清洗液2375孵育清洗2孵育清洗液2375显色显色液3715显色清洗去离子水375显色清洗去
16、离子水375结果判读根据杂交点显色情况进行结果判读。结果类型内参基因PCNC靶基因结果判定1-杂交失败，重复试验2-+-PCR扩增失败，重复试验3+-样品中不含本标准中9中动物源性成分4+-+样品中含有与阳性信号点对应的动物源性成分注：“+”为阳性，“-”为阴性。DB5132/T8820236)洗膜：吸除杂交体系液，加入1mL预热好的杂交清洗液，水平摇床52，90r/min，震荡清洗5min，洗涤2次。7)孵育：吸除杂交清洗液，加入预热好的酶孵育液，42水平摇床90r/min，震荡孵育30min。8)洗膜：吸除酶孵育液，加入1mL预热好的孵育清洗液1，42水平摇床90r/min，震荡清洗5mi
17、n，洗涤2次；吸除孵育清洗液1，加入1mL预热好的孵育清洗液2，37水平摇床90r/min，震荡清洗5min，洗涤2次。9)显色：吸除孵育清洗液2，加入1mL显色液，37静置15min，吸除显色液，加入1mL去离子水37洗涤2次，待膜芯片干燥后进行结果判读。具体流程如表2所示。表2杂交流程表8.6结果判读表3膜芯片结果判定9结果表述9.1牦牛点显色，表述为“检出牦牛成分”；牦牛点未显色，表述为“未检出牦牛成分”。9.2牦牛点与其他靶基因点同时显色，表述为“检出牦牛成分，且混有显色点动物源性成分”。5DB5132/T88202310生物安全及检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测的规定执行。6DB5132/T882023参考文献生物技术通报2020.36（01）：202208PCR膜芯片技术在牦牛及犏牛肉制品的真假鉴定中的应用_7