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1、第八章第八章 免疫学技术在食品检测中的应用免疫学技术在食品检测中的应用 8.9 “不一样的黄金不一样的黄金”-免疫胶体金技术在食品检测中的应免疫胶体金技术在食品检测中的应用用38.9 免疫胶体金技术在食品检测中的应用免疫胶体金技术在食品检测中的应用 免疫胶体金技术免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)：以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种：以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，英文缩写为新型的免疫标记技术，英文缩写为 ICGT。（1）免疫胶体金标记技术原理：蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。）免疫胶体金标记技
2、术原理：蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理：胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而牢固结合。吸附机理：胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而牢固结合。用还原法可从氯金酸制备各种不同粒径，即不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质用还原法可从氯金酸制备各种不同粒径，即不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽等非共价结合，在基础研究和临床实验中成为非常有
3、用的工具。清白蛋白多肽等非共价结合，在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。免疫胶体金测定沙门氏菌免疫胶体金测定艾滋病8.9 免疫胶体金技术在食品检测中的应用（2）胶体金制备：由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如：植物血球凝集素（PHA）、刀豆素（ConA）。Ag-Clen胶体金标胶体金标AbAb一抗
4、一抗抗金标抗金标AbAb二抗二抗直接法胶体金免疫层析技术直接法胶体金免疫层析技术单克隆抗体包被在检测线单克隆抗体包被在检测线 T 处，处，抗金标抗体包被在对照线抗金标抗体包被在对照线 C 处，处，金标抗体吸附在固相载体无纺纱或金标抗体吸附在固相载体无纺纱或NC膜上膜上。在检测线在检测线 T 处形成处形成抗体抗体-待测抗原待测抗原-金标抗体复合物金标抗体复合物 在对照线在对照线 C 处形成处形成抗金标抗体抗金标抗体-金标抗体复合物金标抗体复合物直接法胶体金免疫层析技术直接法胶体金免疫层析技术阳性：测试阳性：测试条条 T，C 处先后处先后出现红色反应线出现红色反应线阴性：测试条阴性：测试条 C 处
5、仅有一条红色对照线出现处仅有一条红色对照线出现无效：测试无效：测试条条 T，C 两处均无红色对照线出现两处均无红色对照线出现Ag-Clen胶体金标胶体金标AbAbClen-BSA二抗二抗AbAb竞争法胶体金免疫层析技术竞争法胶体金免疫层析技术 定性初步结果判定：定性初步结果判定：1、Clen检测检测阴性，阴性，一条可见的一条可见的 T 线线2、Clen检测检测阳性，阳性，一条可见的一条可见的 C 线线78.9 免疫胶体金技术在食品检测中的应用免疫胶体金技术在食品检测中的应用（3）免疫胶体金技术的优点：）免疫胶体金技术的优点：方便快速、敏感性、特异性高，便于基层和现场使用，反应能在方便快速、敏感
6、性、特异性高，便于基层和现场使用，反应能在 15 min 内完成；内完成；定性好、成本低，不需要特殊的仪器设备；定性好、成本低，不需要特殊的仪器设备；应用范围广，可适应多种检测条件；应用范围广，可适应多种检测条件；可以进行多项检测，若阳性样本比较难获得，多项检测可以节省样品，降低成本；可以进行多项检测，若阳性样本比较难获得，多项检测可以节省样品，降低成本；标记物稳定，标记样品在标记物稳定，标记样品在4贮存两年年以上，无信号衰减现象；贮存两年年以上，无信号衰减现象；胶体金本身为红色，无需加入发色试剂，也无标记酶的致癌性底物及终止液步骤，对人体无毒害。胶体金本身为红色，无需加入发色试剂，也无标记酶
7、的致癌性底物及终止液步骤，对人体无毒害。8.9 免疫胶体金技术在食品检测中的应用（4）免疫胶体金技术的应用：胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。测试原理：层析法免疫胶体金检测是免疫金标记技术和抗原抗体反应相结合而形成的一种应用形式，相比ELISA 试剂，除标记物不同外，都是抗原抗体反应的特性。在病原生物学和医学检测中应用：目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatograph
8、y)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用检测新冠病毒、HBsAg、HCG、很多肿瘤标志物，具有简单、快速、准确和无污染等优点。新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM抗体检测试剂盒(胶体金法)8.9 免疫胶体金技术在食品检测中的应用 瘦肉精等违禁药品的检测：瘦肉精；克伦特罗；学名盐酸克伦特罗；是一种平喘药。该药物既不是兽药，也不是饲料添加剂，而是肾上腺类神经兴奋剂。瘦肉精是一类动物用药，有数种药物被称为瘦肉精，例如：莱克多巴胺（Ractopamine）及克伦特罗（Clenbuterol，Clen,CLB）等。近年来，进行一些违禁药品
9、的检测，如罂粟、吗啡、可待因以及现在新出现的一些毒品、违禁品等。GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定胶体金免疫层析法（Colloidal gold immunochromatography，CGI）利用竞争法胶体金免疫层析技术，检测液中的Clen与金标垫上的金标抗体结合形成复合物，若Clen在检测液中浓度低于灵敏度值，未结合的金标抗体流到 T 区时，被固定在膜上的 Clen-BSA偶联物结合，逐渐凝集成一条可见的 C 线；若Clen浓度高于灵敏度值，与金标抗体全部形成复合物，不仅与 T 线处 Clen-BSA偶联物结合形成可见 T 线。未固定的复合物流过 T
10、区，被 C 区的二抗捕获并形成可见的 C 线。出现C 线则表明免疫层析发生，即试纸有效，检测呈阳性。Ag-Clen胶体金标胶体金标AbAbClen-BSA二抗二抗AbAb竞争法胶体金免疫层析技术瘦肉精检测竞争法胶体金免疫层析技术瘦肉精检测 定性初步结果判定：定性初步结果判定：1、Clen检测检测阴性，阴性，一条可见的一条可见的 T 线线2、Clen检测检测阳性，阳性，一条可见的一条可见的 C 线线GB/T 5009.192-2003 动物性食品中克伦特罗残留量的测定根据我国国根据我国国标标GB/T 5009.192-2003 动动物性食品中克物性食品中克伦伦特特罗罗残留量的残留量的测测定，定，
11、即瘦肉精的瘦肉精的检测检测方法方法还还有：气相色有：气相色谱谱-质谱质谱法（法（GC-MS）、高效液相色）、高效液相色谱谱法法（HPLC）/（HPLC-MS）、）、酶酶联联免疫吸附法（免疫吸附法（ELISA）、胶体金免疫）、胶体金免疫层层析法等。析法等。这这几种方法各有几种方法各有优优缺点，而胶体金免疫缺点，而胶体金免疫层层析析试纸试纸条不需要大型条不需要大型设备设备、操作、操作简简单单、成本低廉等、成本低廉等优优点，特点，特别别是家庭主是家庭主妇妇在在农贸农贸市市场购买场购买肉制品肉制品时时可以可以现场检现场检测测而受到而受到认认可可。8.9 免疫胶体金技术在食品检测中的应用 食品中致病微生物及其毒素的检测：食品中激素、苏丹红、三聚氰胺等的检测：隐球菌抗原检测试剂盒（胶体金免疫层析法）黄曲霉毒素M1 胶体金快速检测卡