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1、ICS65.020.01B40DB37山东省地方标准DB37/T35332019驴骡马皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法Identificationofdonkey,mule/hinnyandhorsederivedmaterialsinleatherReal-timefluorescentPCRmethod2019-03-21发布2019-04-21实施山东省市场监督管理局发布DB37/T35332019目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14原理.15试剂或材料.15.1试剂.15.2材料.25.3配制溶液.26仪器设备.37检测用引物和探针.38试验步骤.38.1
2、样本制备.38.2DNA提取.38.3实时荧光PCR反应.39试验数据处理.49.1PCR有效性判定.49.2检测结果分析和表述.410检测过程中防止交叉污染的措施.4附录A（规范性附录）实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系和结果判定.5附录B（资料性附录）目的基因扩增靶标参考序列.7IDB37/T35332019前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东东阿国胶堂阿胶药业有限公司、山东宏济堂制药集团股份有限公司、济南张景牧业科技发展有限公司
3、。本标准主要起草人：张全芳、胡悦、范阳阳、刘艳艳、董书光、徐慧敏、孟朝红、余彩娟、耿加亮、郝大魁、张同清、谭晴晴、步迅、陈淑娟。IIDB37/T35332019驴骡马皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法1范围本标准规定了驴、骡和马3种动物皮张源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。本标准适用于动物皮张及初加工品中驴、骡和马3种源性成分的定性检测。本方法检出限为0.5%。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27
4、403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光PCRreal-timefluorescencePCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。3.2Ct值cyclethreshold每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理根据核基因CKM(creatinekinaseofmuscle)为靶基因设计马属动物通用引物以及驴和马特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值，判定动物皮张驴、马和骡3种动物源性成
5、分。5试剂或材料除另有规定外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。5.1试剂15.2.22TaqManMasterMix：含有TaqDNA聚合酶（终浓度1U/20L）、Mg（终浓度2.0mmol/L）、DB37/T353320195.1.1氯化钠（NaCl）。5.1.2浓盐酸（HCl）。5.1.3三羟甲基氨基甲烷（Trisbase）。5.1.4二水乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O）。5.1.5十二烷基硫酸钠（SDS）。5.1.6蛋白酶冻干品。5.1.7异硫氰酸胍（GuSCN）。5.1.8硅珠。5.1.9无水乙醇。5.2材料5.2.1驴、骡和马3种动物皮张
6、源性成分实时荧光PCR定性检测试剂盒。2+dNTPs（终浓度0.2mmol/L）。5.3配制溶液5.3.11mol/LTris-HCl(pH8.0）溶液：称取12.1g三羟甲基氨基甲烷置于100mL烧杯中，加入80mL水，用浓盐酸调节pH至8.0，转移至100mL容量瓶中,加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压（121）灭菌20min，室温保存待用。5.3.21mol/LTris-HCl(pH6.4）溶液：称取12.1gTris置于100mL烧杯中，加入80mL水，用浓盐酸调节pH至6.4，转移至100mL容量瓶中,加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压（121）灭菌20min，室温保存待用。
7、5.3.30.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液：称取18.61g二水乙二胺四乙酸二钠置于100mL烧杯中，加入80mL水，用10%的氢氧化钠溶液调节pH至8.0，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4KPa蒸气压（121）灭菌20min，室温保存待用。5.3.410%SDS：称取10g十二烷基硫酸钠溶解于80mL无菌水中，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度。储存于灭菌过的容器中待用。5.3.55mol/L氯化钠溶液：称取29.22g氯化钠溶解于80mL无菌水中，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压（121）条件下灭菌20min，室温保存待用
8、。5.3.6细胞裂解液（LysisBuffer）：取1mol/LTris-HCl（pH8.0）20mL，0.5mol/L二水乙二胺四乙酸二钠（pH8.0）5mL，5.0mol/L氯化钠10mL，10%十二烷基硫酸钠5mL，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度。5.3.720mg/mL蛋白酶K溶液：称取0.2g蛋白酶冻干品，加水溶解，转移至10mL容量瓶中，加水定容至刻度，分装后于-20保存。5.3.8RNA酶溶液：称取1g冻干品RNA酶A溶解于6mL无菌水中，于100加热15min，缓慢冷却至室温，转移至10mL容量瓶中，加水定容至刻度，分装成小份存于-20。5.3.9DNA结合液：称取6
9、0g异硫氰酸胍，加入5mL1mol/LTris-HCl（pH6.4）溶液，再加入8mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠（pH8.0），然后再加入4mLTritionX-100溶液（温度60），转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度。5.3.10漂洗液：称取60g异硫氰酸胍，加入5mL1mol/LTris-HCl（pH6.4）溶液，再加入8mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度。2DB37/T353320195.3.11TE缓冲液：量取0.5mL10mmol/LTris-HCl（pH8.0）、0.1mL0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠（pH8.0）
10、加入到容量瓶中，调节pH至8.0，转移至50mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压（121）灭菌20min，降至室温，4保存备用。6仪器设备6.1实时荧光定量PCR仪：4通道以上。6.2电子分析天平：感量0.1mg或0.01g。6.3离心机：最大离心力不小于13000g。6.4振荡型恒温金属浴：0100。6.5高压灭菌锅。6.6低温冰箱：-204。6.7超净工作台。6.8微量移液器：100L1000L，10L200L，2L20L，0.5L10L。6.9容量瓶：10mL，50mL，100mL。7检测用引物和探针内标质控引物探针序列和马属动物通用PCR引物、驴和马的特异性探针序列见附
11、录A中表A.1，引物探针在序列中的位置参见附录B。8试验步骤8.1样本制备盐干皮或鞣制皮张在平整处边缘取约5g，去除毛、脂肪，将试样在无菌水中浸泡20min，用无菌水清洗2次，剪成直径约5mm左右小块，使用液氮充分研磨成粉末。8.2DNA提取8.2.1称取试样30mg5mg于2mL的离心管中，每个样品设立2个平行样，加入400L的DNA提取细胞裂解液、10L蛋白酶K混匀，56水浴2h，期间轻微混匀35次。8.2.2于12000g离心5min，吸取上清液转至新的1.5mL离心管中，加入硅珠悬浮液10L、DNA结合液800L，充分混匀室温静置5min，8000g离心1min，弃上清液。8.2.3加
12、入700L漂洗液，涡旋振荡悬浮10s，8000g离心1min，弃上清液。加入700L的70%乙醇洗涤，8000g离心1min弃上清液，重复此步骤2次。8.2.4于8000g离心30s，吸走残余液体，室温干燥10min，至残余乙醇挥发干。8.2.5加入50LTE缓冲液溶解DNA，加入1LRNA酶溶液，55水浴5min，8000g，离心1min，吸取上清液转移至新的离心管中，-20保存备用。8.2.6紫外分光光度计检测提取的DNA浓度与纯度，测定260nm和280nm处吸光值A260/A280，比值在1.71.9之间，DNA浓度约为0.1ng/L50ng/L。8.2.7也可采用经验证等效的动物组织
13、DNA提取试剂盒，按照使用说明书提取。8.3实时荧光PCR反应3DB37/T353320198.3.1试样实时荧光PCR检测多重实时荧光PCR：将驴、马和骡进行多重实时荧光PCR，PCR反应体系中包括驴和马2种动物源性的特异探针，并加入内标质控体系。PCR反应体系见附录A中表A.2。8.3.2对照实时荧光PCR反应体系每个PCR反应设置3次平行。在试样PCR反应的同时，设置空白对照、阴性对照和阳性对照：a)空白对照：以水作为空白对照；b)阴性对照：以3种动物之外的动物基因组DNA为阴性对照；c)阳性对照：将驴、马和骡3种动物基因组DNA等量混匀作为阳性对照。8.3.3实时荧光PCR反应体系配制
14、按照附录A中表A.2依次加入试剂，配制PCR反应体系，混匀离心分装至PCR反应管中，加入模板DNA，3000g离心1min，取出PCR管，放入荧光定量PCR仪中。8.3.4实时荧光PCR反应程序95预变性3min；95变性10s，62退火延伸35s，40个循环。9试验数据处理9.1PCR有效性判定空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明PCR体系有效：a)空白对照：无FAM和JOE荧光信号，或Ct值40.0，有CY5质控探针的荧光信号，且Ct值35.0；b)阴性对照：无FAM和JOE荧光的S型扩增曲线，或Ct值40.0，有CY5质控探针的荧光信号，且Ct值35.0；c)阳性对照：有F
15、AM、JOE和CY5荧光的S型扩增曲线，且Ct值35.0。否则判定为PCR无效。9.2检测结果分析和表述9.2.1在PCR反应体系有效的情况下，当有FAM、JOE荧光扩增曲线出现，若Ct值35.0，则判定样品中检出相应的动物源性成分；若无典型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的动物源性成分。9.2.2在PCR反应体系有效的情况下，当有FAM、JOE荧光扩增曲线出现，但35.0Ct值40.0，则需要重新提取DNA进行PCR反应。若再次扩增后的Ct值40.0，则判定样品中检出相应的动物源性成分；若再次扩增后无典型扩增曲线，则判定样品中未检出相应的动物源性成分。9.2.3对样品检测结果的判定，见附录A
16、中表A.3。10检测过程中防止交叉污染的措施防治污染的措施按GB/T27403规定执行。4引物探针名称缩写序列（5-3）扩增片段（bp）通用引物-上游CKMFTCATCGTAGCATCGAGGGG228246通用引物-下游CKMRAGCAGAGCAGGAAGGGAGTT内标引物-上游IMFAGACCACCAAATGCCCCTATC140内标引物-下游IMRCGAGATTGAGATCTTCTGCGAC内标探针IMP5CY5-GCGAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGC-3DAB驴源性探针Lv-P5JOE-ATAGTTGAAGGTTCTGAAAATTTTTAGGCAAAGCCT-
17、3BHQ2马源性探针M-P5FAM-ATAGTTGAAGCTTCTGAAAATTTTTAGGTAAAGCCT-3DAB内标序列AGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCG注：通用引物CKMF/CKMR用于驴、马和骡3种动物源性成分检测。试剂名称组分名称加量（L）终浓度2TaqManMasterMix10110PrimerMixCKMF/R20.50mol/LIM
18、F/IMR0.10mol/L10ProbeMixLv-P（JOE）20.10mol/LM-P（FAM）0.20mol/LIMP（CY5）0.10mol/L内标质粒1-310ng/L基因组DNA模板21.0ng100ngddH2O补至20LDB37/T35332019AA附录A（规范性附录）实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系和结果判定A.1实时荧光定性PCR引物和探针序列实时荧光定性PCR引物和探针序列见表A.1。表A.1实时荧光定性PCR引物和探针序列A.2实时荧光PCR反应体系实时荧光定性PCR引物和探针序列见表A.2。表A.2多重实时荧光PCR反应体系A.3对各种样品检测结果的判定
19、对各种样品检测结果的判定见表A.3。5FAM荧光JOE荧光CY5荧光结果判定Ct35Ct35多重PCR体系检出马源性成份未检出驴源性成分或含量低于检测界限多重PCR体系检出驴源性成分未检出马源性成分或含量低于检测界限多重PCR体系检出骡源性成分未检出驴、马及骡源性成分或含量低于检测界限多重PCR体系如果同时进行的阳性对照实验结果正常，检测实际样品时只有CY5荧光检出，无FAM、JOE荧光检出，判定为未检出驴、马和骡3种动物源性成分。多重PCR体系PCR反应失败。注意以下几个方面后再次进行反应。如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则可能是样品DNA制备有问题，如样品中可能存在抑制物等。如果同时进
20、行的阳性对照实验结果不正常，则可能是实验操作失败或试剂失活。DB37/T35332019表A.3实时荧光PCR定性检测方法各种实验结果的判定6DB37/T35332019BB附录B（资料性附录）目的基因扩增靶标参考序列B.1马(Equuscaballus)PCR产物序列（Genbank:JQ065978.1）马(Equuscaballus)PCR产物序列（Genbank:JQ065978.1）TTCCCGAATTCGCCTGCGACTCATCGTAGCATCGAGGGGAGAGGCTCTCTCTTTCCCGGCCTCTCTCTCCCCATCTCGGAAACAACCGGATCTTTCAAGTCT
21、CTGCTTATCTGTGGGAGCTGATAGTTGAAGCTTCTGAAAATTTTTAGGTAAAGCCTCCAGGATTTGGGGACTCTGAAATGGGAATACTTTTCATACCTTGTCACTGGCCCCCTGAAACTCCCTTCCTGCTCTGCTGGGCCCCCCB.2驴（Equusasinus）PCR产物序列(Genbank:HQ336263.1)驴（Equusasinus）PCR产物序列(Genbank:HQ336263.1)TTCCCGAATTCGCCTGCGACTCATCGTAGCATCGAGGGGAGAGGCTCTCTCTTTCCCGGCCTCTCTCTCCC
22、CATCTCGGAAATAACTGGATCTTTTAAGTCTCTGCTTATCTGTGGGAGCTGATAGTTGAAGGTTCTGAAAATTTTTAGGCAAAGCCTCCAGGATTTGGGGACTCTGAAATGGGAATACTTTTCGTACCTTGTCACTGGCCCCCTGAAACTCCCTTCCTGCTCTGCTGGGCCCCCCB.3内标质粒内标质粒TGCACTCCTCCTGCATATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATTCCTTGGACACATAAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTTTATTCTTCTACGGTACCTTGCTTTAATCCTAAATGGCAAACTCC注：下划线为引物位置，阴影部分为探针位置。_7