《DB34_T 4268-2022 发酵茶中B族和G族黄曲霉毒素的测定.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DB34_T 4268-2022 发酵茶中B族和G族黄曲霉毒素的测定.docx（13页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、ICS67.140CCSX5534安徽省地方标准DB34/T42682022发酵茶中B族和G族黄曲霉毒素的测定DeterminationofaflatoxinBandGgroupsinfermentedtea2022-08-31发布2022-09-30实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T42682022前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由安徽农业大学提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽农业大学、安徽省茶业集团有限公司、肥西县
2、农业综合服务中心、云南微生物研究所。本文件主要起草人：周育、管道健、张海柱、唐蜀昆、张梁、王希春。IDB34/T42682022发酵茶中B族和G族黄曲霉毒素的测定1范围2本文件规定了发酵茶中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G（以下简称AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）的测定方法。本文件第一法为双柱净化-高效液相色谱柱后光化学衍生法，适用于发酵茶中黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1和AFG2含量的测定。本文件第二法为双柱净化-液相色谱柱串联质谱法，适用于发酵茶中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2含量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引
3、用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB5009.22食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4第一法双柱净化-高效液相色谱柱后光化学衍生法原理试样中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取，提取液经多功能净化柱和免疫亲和柱净化和富集，净化液经浓缩、定容和过滤后，经液相色谱分离，柱后光化学法衍生，荧光检测器检测。外标法定量。试剂及材料除非另有说明，本方法
4、所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.2.1试剂4.2.1.1甲醇（CH3OH，CAS：67-56-1）：色谱纯。4.2.1.2乙腈（CH3CN，CAS：75-05-8）：色谱纯。4.2.1.3氯化钠（NaCl，CAS：7647-14-5）。4.2.1.4磷酸氢二钠（Na2HPO4，CAS：7558-79-4）。4.2.1.5磷酸二氢钾（KH2PO4，CAS：7778-77-0）。4.2.1.6氯化钾（KCl，CAS：7447-40-7）。4.2.1.7盐酸（HCl，CAS：7647-01-0）。1DB34/T426820224.2.1.8吐温-20（C58H114O26，
5、CAS：9005-64-5）。4.2.1.9硫酸镁（MgSO4，CAS：7487-88-9）。4.2.1.10聚乙烯基吡络烷酮（PVP，CAS：9003-39-8）。4.2.1.11N-丙基乙二胺（PSA，CAS：111-39-7）。4.2.2材料4.2.2.1移液管：1mL和5mL规格。4.2.2.2针筒式滤器：100mL规格，可连接于空气压力泵或手动加压。4.2.2.3玻璃纤维滤纸：快速、高载量、液体中颗粒保留1.6m。4.2.2.4真菌毒素多功能净化柱（以下简称多功能净化柱）。4.2.2.5免疫亲和柱：AFB1柱容量200ng，AFB1柱回收率80%，AFG2的交叉反应率80%。4.2.
6、2.6一次性针式过滤器：带0.22m有机相微孔滤膜。4.2.3试剂配制4.2.3.1乙腈-水溶液（84+16）：取840mL乙腈加入160mL水，混匀。4.2.3.2甲醇-水溶液（70+30）：取700mL甲醇加入300mL水，混匀。4.2.3.3磷酸盐缓冲溶液（以下简称PBS）：称取8.00g氯化钠、1.20g磷酸氢二钠、0.20g磷酸二氢钾、0.20g氯化钾，用900mL水溶解，用盐酸调节pH至7.4，用去离子水定容至1000mL。4.2.3.4含1%吐温-20的PBS：取10mL吐温-20，用PBS定容至1000mL。4.2.4标准品4.2.4.1AFB1标准品（C17H12O6，CAS
7、：1162-65-8）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.4.2AFB2标准品（C17H14O6，CAS：7220-81-7）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.4.3AFG1标准品（C17H12O7，CAS：1165-39-5）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.4.4AFG2标准品（C17H14O7，CAS：7241-98-7）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.2.5标准溶液配制4.2.5.1标准储备溶液分别称取AFB1、AFB2、AFG1和AFG2各1mg（精确至0.01mg），
8、用乙腈溶解并定容至100mL。各溶液浓度为10g/mL，溶液转移至试剂瓶中后，在-20下避光保存、备用，有效期三个月。临用前，参照GB5009.22进行浓度校准。4.2.5.2混合标准工作液（AFB1和AFG1：各100g/L，AFB2和AFG2：各25g/L)移液管准确移取AFB1和AFG1标准储备溶液各1mL，AFB2和AFG2标准储备溶液各250L至100mL容量瓶中，乙腈定容。密封后避光-20下保存，一个月内有效。4.2.5.3标准系列工作溶液稀释2DB34/T42682022准确移取混合标准工作液，按照样品检测需求，以乙腈为溶剂作适度的梯度稀释，以符合分析检测要求。仪器和设备4.3.
9、1高速粉碎机。4.3.2涡旋振荡器或摇床。4.3.3天平：感量0.01g和0.00001g。4.3.4涡旋混合器。4.3.5离心机：转速6000g。4.3.6固相萃取装置：配15mL-50mL免疫亲和层析针筒。4.3.7空气压力泵。4.3.8氮吹仪。4.3.9液相色谱仪：配荧光检测器。4.3.10液相色谱柱。4.3.11黄曲霉毒素光化学柱后衍生器。4.3.12筛网:1mm2mm试验筛孔径。分析步骤4.4.1取样4.4.1.1茶汤采样量需大于1L，将所有液体样品在一个容器中混匀后，取其中任意的100mL样品，供检测用。4.4.1.2干茶采样量需大于1.0kg，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径
10、小于2mm，混合均匀后，以四分法缩分至100g，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。4.4.2提取4.4.2.1茶汤取50mL试样（精确至0.01mL），然后加入50mL乙腈（精确至0.01mL），7.5g氯化钠（精确至0.01g），涡旋1min，6000g离心10min，取上清液，再加入50mL乙腈重复提取，然后合并两次上清液，并加入2g氯化钠（精确至0.01g），2g硫酸镁（精确至0.01g），5gPVP（精确至0.01g），2gPSA（精确至0.01g），6000g离心10min，上清液用玻璃纤维滤纸过滤，收取虑液备用。4.4.2.2干茶称取5g试样（精确至0.01g）于50mL离心管中
11、，加入25mL乙腈-水溶液（4.2.3.1）或甲醇-水溶液（4.2.3.2），涡旋混匀，置于涡旋振荡器或摇床中振荡20min，将茶叶及取提液全部转移至针筒式滤器，真空抽滤（或手动加压过滤）。收集全部提取液于离心管中，在6000g下离心10min，上清液用玻璃纤维滤纸过滤，收取虑液备用。4.4.3净化3DB34/T426820224.4.3.1多功能净化柱净化移取适量上清液，按多功能净化柱的操作说明进行净化，收集全部净化液，并确保净化液多于4mL。4.4.3.2免疫亲和柱净化4.4.3.2.1上样液的准备用刻度移液管准确吸取上步的净化液4mL（茶汤样品20mL或依据浓度适当调整），加入46mL含
12、1%吐温-20的PBS（使用甲醇-水溶液作为黄曲霉毒素提取溶剂时，加入含1%吐温-20的PBS可减半加入），混匀。4.4.3.2.2免疫亲和柱准备将26条件下保存的免疫亲和柱从冷藏条件下取出，恢复至室温连接于固相萃取装置。4.4.3.2.3亲和层析净化待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液（4.4.3.2.1）移至50mL注射器筒中（或按照批次分批次移入10mL-20mL注射器筒），调节下滴速度，控制样液以每秒一滴的速度稳定流过免疫亲和柱。样液流完后，向注射器筒内加入10mL含1%吐温-20的PBS，以每秒2滴的流速淋洗免疫亲和柱，并重复一次净化步骤。待清洗液流完后，用空气压力泵吹干免疫亲和
13、柱。脱离真空系统，在亲和柱下部放置5mL刻度试管，加入2mL甲醇，以每秒1滴的速度洗脱免疫亲和柱，再用空气压力泵吹干免疫亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。在50条件下，用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加入1.0mL甲醇-水溶液（45:55，V/V），涡旋30秒溶解残留物，过0.22m有机滤膜过滤，收集滤液待测。4.4.4液相色谱参考条件高效液相色谱参考条件如下：a)流动相：A相：水；B相：甲醇；b)等梯度洗脱条件：A相：55%；B相：45%；c)色谱柱：C18柱（柱长250mm或150mm，柱内径4.6mm，填料粒径5m)，或相当者；d)流速：0.8mL/min；e)柱温：40；f)进样量：10L
14、；g)光化学柱后衍生器；h)激发波长：360nm；发射波长：440nm；i)液相色谱图参见附录A。4.4.5定性检测试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准品色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在2.5%之内。4.4.6标准曲线制作41000𝐴𝑠𝑚(1)DB34/T42682022在4.4.4的液相色谱分析条件下，将标准系列溶液由低到高浓度进样检测，以AFB1、AFB2、AFG1和AFG2色谱峰面积与各对应浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数应大于0.99。4.4.7空白试验称取不含黄曲霉毒素的空白试样，按照上述同样的提取、净化和检测步
15、骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。分析结果计算与表述试样中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的含量，用上述外标法的标准曲线，以待测样品目标毒素的峰面积，按照公式（1）计算出毒素浓度，计算结果保留三位有效数字，单位为（g/kg或g/L）。𝐶=1000(𝐴𝐴0)𝜌𝑉式中：C试样中AFB1、AFB2、AFG1或AFG2的含量，单位为微克每千克或微克每升（g/kg或g/L）；标准工作液中黄曲霉毒素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；A样液中黄曲霉毒素的峰面积；A0空白样液中黄曲霉毒素的峰面积；V样液最终
16、定容体积，单位为毫升（mL）；m最终样液所代表的试样量，单位为克或毫升（g或mL）；AS标准工作液中黄曲霉毒素的峰面积。精密度在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值，不得超过算术平均值的20%。检测限当称取样品5g（或50mL）时，AFB1的检出限为0.04g/kg（或g/L），AFB2的检出限为0.02g/kg（或g/L），AFG1的检出限为0.04g/kg（或g/L），AFG2的检出限为0.02g/kg（或g/L）。5第二法双柱净化-液相色谱柱串联质谱检测法原理试样中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取，提取液用含1%吐温-20的磷酸盐缓冲溶
17、液稀释后，经黄曲霉毒素多功能净化柱初步净化，再用免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后，经液相色谱分离，串联质谱检测。外标法定量。试剂和材料5.2.1试剂同4.2.1。5.2.2材料同4.2.2。5DB34/T426820225.2.3试剂配制同4.2.3。5.2.4标准品同4.2.4。5.2.5标准溶液配制同4.2.5。仪器和设备5.3.1高速粉碎机。5.3.2涡旋振荡器或摇床。5.3.3天平：感量0.01g和0.00001g。5.3.4涡旋混合器。5.3.5空气压力泵。5.3.6离心机：转速6000g。5.3.7固相萃取装置：配15mL50mL免疫亲和层析针筒。5.3.8氮吹仪。5
18、.3.9筛网：1mm2mm试验筛孔径。5.3.10液相色谱-串联质谱仪：带电喷雾离子源。分析步骤5.4.1取样同4.4.1。5.4.2提取同4.4.2。5.4.3净化同4.4.3。5.4.4液相色谱参考条件高效液相色谱参考条件如下：a)流动相：A相：水；B相：甲醇；b)梯度洗脱：95%A相（0min5min），95%35%A相（5min7.5min），95%A相（7.5min10min）；c)色谱柱：C18柱（柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.7m），或相当者；d)流速：0.4mL/min；e)柱温：25；f)进样体积：1.0L。5.4.5质谱参考条件6c)离子选择参数：离子化方式
19、，ESIM+H；AFB1，母离子313/定量离子241，定性离子269；1000𝐴𝑠𝑚(2)DB34/T42682022质谱参考条件列出如下：a)检测方式：多离子反应监测（MRM）；b)离子源控制条件：电离方式，ESI；毛细管电压，1.5kV；碰撞能量，6eV；锥孔电压，40V；离子源温度，120；锥孔反吹气流量，50L/h；脱溶剂气温度，500；脱溶剂气流量，900L/h；电子倍增电压650V；+AFB2，母离子315/定量离子259，定性离子287；AFG1，母离子329/定量离子243，定性离子215；AFG2，母离子331/定量离子285
20、，定性离子245；d)总离子流图：参见附录B；e)子母离子扫描图：参见附录C。5.4.6定性检测5.4.6.1试样中各目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在2.5%之内。5.4.6.2每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子；同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过规定的范围（相对离子丰度50%，允许相对偏差20%；相对离子丰度20%50%，允许相对偏差25%；相对离子丰度10%20%，允许相对偏差30%；相对离子丰度10%，允许相对偏差50%）。5.4.7标准曲线
21、制作在5.4.4和5.4.5的液相色谱串联质谱仪分析条件下，将标准系列溶液由低到高浓度进样检测，以AFB1、AFB2、AFG1和AFG2色谱峰面积与各对应浓度作图，得到标准曲线回归方程，其线性相关系数应大于0.99。5.4.8试样溶液的测定及浓度范围调整取5.4.3中净化得到的待测溶液进样，按照5.5公式计算样品中各待测物含量。待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内，若超过线性范围则应进行适当稀释提取液或减少取样量重新测定。5.4.9空白试验称取不含黄曲霉毒素的试样，按照上述5.4.15.4.8同样的提取、净化和检测步骤做空白实验。确认不含有干扰待测组分的物质。分析结果计算与表述试样中AFB
22、1、AFB2、AFG1和AFG2的含量，用上述外标法标准曲线确认线性范围，以待测样品目标毒素的峰面积，按照公式（2）计算出毒素浓度，计算结果保留三位有效数字，单位为（g/kg或g/L）。𝐶=1000(𝐴𝐴0)𝜌𝑉式中：C试样中AFB1、AFB2、AFG1或AFG2的含量，单位为微克每千克或微克每升（g/kg或g/L）；标准工作液中黄曲霉毒素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；A样液中黄曲霉毒素的峰面积；A0空白样液中黄曲霉毒素的峰面积；7DB34/T42682022V样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m最终
23、样液所代表的试样量，单位为克或毫升（g或mL）；AS标准工作液中黄曲霉毒素的峰面积。精密度在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。检测限当称取样品5g（或50mL）时，AFB1的检出限为0.02g/kg（或g/L），AFB2的检出限为0.05g/kg（或g/L），AFG1的检出限为0.1g/kg（或g/L），AFG2的检出限为0.21g/kg（或g/L）。8DB34/T42682022AA附录A（资料性）黄曲霉毒素AFB1，AFB2，AFG1，AFG2液相色谱图A1为四种黄曲霉毒素添加回收样品色谱峰；A2为四种黄曲霉毒素标准品色谱峰。图A.1黄曲霉毒素AFB
24、1，AFB2，AFG1，AFG2液相色谱图9DB34/T42682022BB附录B（资料性）黄曲霉毒素AFB1，AFB2，AFG1，AFG2总离子流扫描图B1为AFB1总离子峰；B2为AFB2总离子峰；B3为AFG1总离子峰；B4为AFG2总离子峰。图B.1黄曲霉毒素AFB1，AFB2，AFG1，AFG2总离子流扫描图10DB34/T42682022CC附录C（资料性）黄曲霉毒素AFB1，AFB2，AFG1，AFG2字母离子扫描图C1为AFB1母离子扫描图；C1-1为AFB1子离子扫描图；C2为AFB2母离子扫描图；C2-2为AFB2子离子扫描图；C3为AFG1母离子扫描图；C3-3为AFG1子离子扫描图；C4为AFG2母离子扫描图；C4-4为AFG2子离子扫描图。图C.1黄曲霉毒素AFB1，AFB2，AFG1，AFG2子母离子扫描图11