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1、 ICS 11.020 CCS C 50 13 河北省地方标准 DB 13/T 58612023 疾病预防控制机构病原微生物核酸检测质量管理技术规范 2023-10-25 发布 2023-11-25 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 58612023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由河北省卫生健康委员会提出。本文件由河北省卫生健康标准化技术委员会（HeB/TC 25）归口。本文件起草单位：河北省疾病预防控制中心、石家庄市疾病预
2、防控制中心。本文件主要起草人：李军、姜彩肖、宋红梅、曹江雪、何宝花、王伟、冯彤、崔玉杰、刘继敏、黄卫华、陈建、李国风。DB 13/T 58612023 1 疾病预防控制机构病原微生物核酸检测质量管理技术规范 1 范围 本文件规定了疾病预防控制机构病原微生物核酸检测质量管理的基本要求、质量保证、污染控制等内容。本文件适用于疾病预防控制机构病原微生物核酸检测质量管理。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489-2008 实
3、验室生物安全通用要求 JJF 1874-2020 (自动)核酸提取仪校准规范 JJG 646-2006 移液器 RB/T 214-2017 检验检测机构资质认定能力评价 检验检测机构通用要求 TSG 21-2016 固定式压力容器 WS 233-2017 病原微生物实验室生物安全通用准则 YY 0569-2011 II 级生物安全柜 YY/T 1173-2010 聚合酶链反应分析仪 分子诊断检验程序性能验证指南 3 术语和定义 GB 19489-2008、JJF 1874-2020、JJG 646-2006、RB/T 214-2017、WS 233-2017、消毒技术规范界定的及下列术语和定义
4、适用于本文件。实时荧光定量PCR仪 quantitative real-time polymerase chain reaction analyzer 基于聚合酶链式反应原理，通过温度变化循环程序进行靶互酸片段的体外扩增，同时对循环过程中荧光信号进行实施采集和处理，定量或定性分析靶核酸片段的仪器。产物分析 result analysis 判断检测到的荧光强度是否能证实实验样本包含目标病原体遗传物质的实验活动。质量保证 quality assurance,QA 为满足核酸检测质量要求提供充分可信性所必要的有计划的系统的措施。4 基本要求 实验室设置 4.1.1 疾病预防控制机构核酸检测实验室，应
5、独立设置，配备高压灭菌区。4.1.2 核酸检测实验室宜参照医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法 医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 布局建设；生物安全应符合 GB 19489-2008 中二级生物安全实验室（BSL-2）或 WS 233-2017 中加强型 BSL-2 实验室要求，并备案。4.1.3 核酸检测实验室宜设置以下区域：试剂储存和准备区、样本制备区、扩增区、扩增产物分析区。各区域在物理空间上应是完全相互独立的，无论是在空间上还是在使用中，应始终处于完全分DB 13/T 58612023 2 隔状态，不得有空气的直接相通。使用实时荧光定量 PCR 仪时，扩增区和扩增产物分析区可合
6、并。采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。4.1.4 设计为机械通风的核酸检测实验室各工作区应设缓冲间，人员通过缓冲间进出相应的工作区。负压工作区，气压由走廊向缓冲间、核心工作间方向递减，形成定向气流趋势；各区之间气压应由试剂储存和准备区向样本制备区、扩增区、扩增产物分析区递减，各区之间应设置能互锁的传递窗。各区换气次数应不少于 10 次/小时。设施设备 4.2.1 基本配置 4.2.1.1 试剂储存和准备区应配备：a)28和-20冰箱；b)超净工作台或生物安全柜；c)微量加样器；d)可移动紫外灯；e)离心机；f)混匀器；g)耗材：一
7、次性手套、加样器吸头、锐器盒、PCR 管（八联管）、PCR 板；h)专用工作服和工作鞋（套）；i)专用数据记录与传输设备。4.2.1.2 样本制备区应配备：a)28冰箱、-20或-80冰箱；b)离心机；c)混匀器；d)水浴箱或加热模块；e)核酸提取仪；f)微量加样器；g)可移动紫外灯；h)II 型生物安全柜；i)耗材：一次性手套、加样器吸头（带滤芯）、锐器盒；j)专用个人防护装备（依操作的病原微生物分类确定）；k)专用数据记录与传输设备。4.2.1.3 扩增区应配备：a)荧光定量 PCR 仪；b)可移动紫外灯；c)专用工作服和工作鞋（套）；d)专用数据记录与传输设备。4.2.1.4 扩增产物分
8、析区应配备：a)微量加样器；b)可移动紫外灯；c)消耗品：一次性手套、加样器吸头（带滤芯）；d)专用工作服和工作鞋（套）；e)专用数据记录与传输设备。注：本区配置视产物分析方法不同而定。实验室宜根据自己使用的方法或试剂的要求，增加相应的仪器设备。4.2.2 试剂与耗材 使用部门根据核酸检测需求，提出申购计划，对试剂的关键性能参数如精密度、符合率和检出限等进行性能验证，验证方法可参照CNAS-GL039分子诊断检验程序性能验证指南。DB 13/T 58612023 3 试剂储存应按照试剂盒存储要求进行，超出有效期的试剂与耗材应与有效期内的试剂耗材分开暂存。暂存期限不应超过本单位与医疗废物处置机构
9、签订的处理周期，并分别按照化学性和感染性医废处置。4.2.3 质控品 检测过程中需使用试剂盒自带的质控品和可溯源至有证标准物质的第三方质控品。使用需遵守以下原则：a)严格按质控品说明书操作；b)冻干质控品的复溶要确保所用溶剂的质量；c)冻干质控品复溶时所加的量要准确，并尽量保持每次加入量的一致；d)冻干质控品复溶时应轻轻摇匀，使内溶物完全溶解，切忌剧烈震摇；e)质控品应严格按使用说明书规定的方法保存，不使用超过保质期的质控品；f)质控品要在与样本同样测定条件下进行测定。4.2.4 设备检定/校准 核酸检测涉及的检测设备应开展周期检定，校准周期由实验室根据设备的实际使用情况，选择具有CMA或CN
10、AS资质的检测校准机构，按以下标准进行：a)核酸提取仪，JJF 1874-2020；b)实时荧光定量 PCR 仪，YY/T 1173-2010；c)移液器，JJG 646-2006；d)生物安全柜，YY 0569-2011；e)高压蒸汽灭菌器，TSG 21-2016。校准周期由实验室根据设备使用情况确定。也可参考校准证书建议的有效时长，并在使用前对校准结果进行确认。4.2.5 期间核查 实时荧光定量PCR仪在两次校准之间，应对其控温系统和荧光系统进行期间核查。检测人员应按照期间核查规程进行核查，并保留记录。应考虑以下因素：a)检测/校准方法要求；b)实时荧光定量 PCR 仪稳定性；c)校准周期
11、；d)历次校准结果和变化趋势；e)设备维护保养情况。人员 4.3.1 实验室负责人 核酸检测实验室应指定专职或兼职负责人，应具有中级以上专业技术职称或同等能力。实验室负责人全面负责技术运作和人员管理，并指定负责人的代理人。4.3.2 检测人员 4.3.2.1 实验室检测技术人员应具备实验室工作经历以及相关专业技术技能，接受过核酸检测技能培训，并通过理论考核。上岗前应由实验室负责人进行能力确认，并由熟悉检测目的、程序、方法和结果评价的人员，对检测人员进行监督。4.3.2.2 检测人员健康和培训管理应符合 WS 233-2017 要求。4.3.3 特种作业人员 从事压力容器的操作人员应按照国家有关
12、规定经特种设备安全监督管理部门培训，取得国家特种作业人员证书，方可从事相应的作业。DB 13/T 58612023 4 4.3.4 档案管理员 实验室应设立专职或兼职档案管理员，档案管理员职责应符合WS 233-2017要求。样本 检测人员应根据样本特点，对样本的接收、流转、保管、处理及样本的识别等各个环节制定管理和控制程序。检测样本包含但不限于：a)上呼吸道样本，包括鼻咽拭子、咽拭子等；b)下呼吸道样本，深咳痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液、呼吸道吸取物等；c)便样本/肛拭子，如果不便于留取便样本，可采集肛拭子；d)血清样本，应使用无抗凝剂的真空釆血管；e)其他体液样本，需采集脑脊液或疱疹液进
13、行检测的病原体（如：柯萨奇病毒、疱疹病毒等）；f)环境样本，按目标病原微生物相关防控方案采集；g)食品；h)水。注：用于核酸检测的样本应尽快进行检测，在24小时内检测的样本可置于4保存；24小时内无法检测的样本则应置于-80或以下保存（如无-80保存条件，则于-20冰箱暂存）。应设立专库或专柜单独保存样本。5 质量保证 标准操作程序 实验室应制定核酸检测标准操作程序（SOP），并严格按照SOP进行操作。实验室自接到样本后，应依据SOP完成样本清点核对、试剂准备、样本前处理、核酸提取、核酸扩增、产物分析及报告。实验室应建立可疑样本复检的流程。样本处理 5.2.1 人体样本采集、运输、存储应按照相
14、应的病原体监测方案、技术指南和标准进行。针对不同种类样本（如全血、血浆、血清、疱疹液、脑脊液、痰、灌洗液、疱疹液、尿、便等）和不同病原体，作出样本查验、接收、登记、保存、记录（指保存期间的相关技术参数如保存温度、位置、存取时间、存取次数等）、销毁等的规定。样本处理过程应按照核酸检测试剂盒说明书要求进行。5.2.2 食品、环境和水等样本需按照不同病原体监测方案要求，进行采集，运输，存储和检测前的样本处理。核酸提取 选择磁珠法、膜吸附法等进行核酸提取，可根据核酸提取试剂及扩增体系的要求选择配套的样本采样管，在生物安全柜内打开样本采集管加样。按照核酸提取试剂盒的说明，继续核酸提取步骤，核酸提取完成后
15、立即封盖。聚合酶链反应 在生物安全柜内取核酸加至PCR 扩增反应体系中。将扩增体系放入实时荧光定量PCR仪，按照试剂盒说明书设置扩增程序，启动扩增程序。产物分析 符合弱阳性质控品能够被检出，阴性样本对照、水、反应液对照阴性，阳性对照阳性，阴性对照阴性要求的判定为本次核酸检测过程合格，结果判断如下：a)无 Ct 值、无 S 形扩增曲线，可报告阴性；b)Ct 值小于等于试剂规定检出限，且有 S 形扩增曲线，可报告为阳性；c)Ct 值位于灰区，建议重复实验，若重做 Ct 值仍处于灰区，但出现明显的 S 形扩增曲线，该样本判断为阳性，否则为阴性。注：如使用商品化试剂盒，则以厂家提供的说明书为准。结果报
16、告 DB 13/T 58612023 5 检测机构应按照RB/T 214-2017要求出具检测报告，有CMA资质可加盖CMA章，无CMA资质可加盖检验检测章或单位公章。室内质控 实验室应开展室内质控，每批检测至少有1份弱阳性对照（不高于检测试剂检出限的1.53倍），13份阴性对照，分别是阴性样本对照（可采用本实验室证实为阴性的标本）、水与反应液对照和仅反应液对照。阴性对照和阳性对照随机放入检测样本中，参与扩增的全过程。外部质控 实验室应每年参加上级单位组织的考核或实验室间比对。出现不符合结果时，应采取纠正措施，实施纠正，保持实验室检测能力满足检测任务要求。6 污染控制 实验环境 应定期对实验区
17、域进行消毒，可用75%酒精对实验室环境进行擦拭消毒；紫外线辐射消毒；采用去除DNA污染的试剂对实验区域进行消毒清洁，实验室地面用含有有效氯1000mg/L2000mg/L的含氯消毒剂擦拭或喷洒消毒，然后用拖布蘸清水擦拭残余消毒剂，加强通风。实验设备 实验结束后，生物安全柜应以含有有效氯1000mg/L含氯消毒剂擦拭消毒作用30分钟，然后，用湿巾擦拭残余消毒剂。或用75%酒精（75%酒精湿巾）擦拭消毒，继续通风10分钟后，开启紫外线消毒30分钟。实验区设备、物品应使用去除DNA污染的试剂喷洒一定时间后，再用纸巾进行擦拭，随后用75%酒精喷洒并用纸巾擦拭干净。医疗废物 6.3.1 处置原则 医疗废
18、物的处置应按照医疗废物管理条例和医疗卫生机构医疗废物管理办法的要求。6.3.2 医疗废物收集 核酸检测实验室应按以下要求收集检测过程中产生的医疗废物：a)工作液配制过程产生的医疗废物应规范使用双层黄色医疗废物收集袋封装，转移至高压灭菌区。b)核酸提取过程产生的废物规范使用双层黄色医疗废物收集袋封装，用含有效氯 1000mg/L2000mg/L 的含氯消毒剂喷洒表面转移至高压灭菌区。c)扩增完成后，反应管不可开盖，应规范使用双层黄色医疗废物收集袋封装，转移至高压灭菌区。6.3.3 医疗废物高压处置 核酸检测实验室收集的医疗废物经高压蒸汽灭菌器121 30分钟高压后，按类别黏贴标识，注明核酸检测实
19、验室，医废种类、数量等，转移至医疗废物临时集中存放处。6.3.4 交接 核酸检测实验室应与临时集中存放处管理部门进行医疗废物交接，填写实验室废物交接登记表，一式两份，双方各存一份。6.3.5 转运 临时集中存放处管理部门与取得资质的医废无害化处置单位签订医废处置合同，定期转运。个人防护 DB 13/T 58612023 6 实验室应配备二级以上个人防护用品。实验室对个人防护用品的选择、使用、维护应有明确的程序和使用指导，可根据病原微生物危害等级分类，采取相应防护措施。检测人员需充分了解其实验工作的性质和特点，接受防护装备的使用培训，并正确使用个体防护装备。有特殊规定的按其要求执行。实验操作 实
20、验操作应符合GB 19489-2008附录B和附录C的要求，应避免发生污染实验环境、危及自身和他人安全、破坏样本以及不必要的操作。清洁用具 不同的实验区域应有其各自的清洁用具。基本原则是，由清洁区向污染区进行，洁具不可交叉。清洁消毒顺序依次为试剂储存和准备区、样本制备区、扩增区、扩增产物分析区。DB 13/T 58612023 7 参考文献 1中华人民共和国国务院.病原微生物实验室生物安全管理条例国务院令第424号，北京：中华人民共和国国务院，2004-11-12.2 中华人民共和国卫生部.医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法卫办医政发 2010194号，北京：中华人民共和国卫生部，2010-12-06.3中华人民共和国国务院.特种设备安全监察条例国务院令第373号，北京：中华人民共和国国务院，2003-06-01.4中华人民共和国国务院.医疗废物管理条例国务院令第380号，北京：中华人民共和国国务院，2003-06-16.5中华人民共和国卫生部.医疗卫生机构医疗废物管理办法 卫生部第36号，北京：中华人民共和国卫生部，2003-10-15.6 国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组.新型冠状病毒肺炎防控方案（第九版）联防联控机制综发202271号，北京：国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组，2022-06-27.