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1、ICS67.080.20CCSB3143湖南省地方标准DB43/T28122023普通丝瓜杂交种纯度鉴定（SSR法）技术规程Codeofpracticeforpurityidentificationofspongegourdhybrid(SSRmethod)2023-11-09发布2024-02-09实施湖南省市场监督管理局发布DB43/T28122023目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13原理.14主要仪器设备、试剂耗材.15试剂配制.26引物.27鉴定流程.28纯度计算.3附录A（资料性）常用试剂配方.5附录B（资料性）引物信息.7IDB43/T28122023前言本文件按照GB
2、/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件主要起草单位：湖南省蔬菜研究所、长沙市农业科学研究院、长沙县农业局、岳阳市农业科学研究院，湖南湘妹子农业科技有限公司。本文件起草人：韩小霞、胡新军、闵子扬、李勇奇、邓稳桥、卢亚楠、刘昆言、粟建文。IIDB43/T28122023普通丝瓜杂交种纯度鉴定（SSR法）技术规程1范围本文件规定了丝瓜杂交种纯度鉴定的主要仪器设备、试剂耗材、试剂配制、引物、鉴定流程和纯度计算。本
3、文件适用于普通丝瓜杂交种纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样3原理SSR标记技术是一种以特异引物PCR扩增为基础的分子标记技术。由于SSR标记广泛存在于植物基因组上，不同材料每个位点重复单位的数量及序列可能不同，故而形成扩增片段的长度多态性。根据扩增片段电泳谱带的差异，可鉴定杂交种纯度。4主要仪器设备、试剂耗材主要仪器设备研钵、镊子、电子天平（精度值为0.001）、高速台式离心机、
4、恒温水浴锅、紫外分光光度计、PCR扩增仪、电泳仪、垂直电泳槽、凝胶成像系统、酸度计、微量移液器、摇床、高压灭菌锅、通风柜、胶片观察灯、数码相机、4冰箱和-20冰箱。主要试剂乙二胺四乙酸二钠（Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt，EDTA-2Na）、盐酸（HCl）、氢氧化钠（NaOH）、三羟甲基氨基甲烷【Tris(hydroxymethyl)methylaminomethane，Tris）】、三氯甲烷(Chloroform)、十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfonate，SDS）、乙醇（Ethanol）、异丙醇（Isopropano
5、l）、异戊醇（Isoamylalcohol）、TaqDNA聚合酶、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉双丙烯酰胺（N，N，-methylemebisacrylamide）、四甲基乙二胺（TEMED）、硼酸（Boricacid）、过硫酸铵（Ammoniumpersulfate）、硝酸银（Silvernitrate）、冰醋酸（Glacialaceticacid）、醋酸钠（Sodiumacetate）、甲醛（Formaldehyde）、水（H2O）符合GB-T6682-2016规定。主要耗材离心管（0.6ml、1.5ml、2.0ml）、枪头
6、（白枪头、黄枪头、蓝枪头）、枪头盒、48孔板、96孔PCR扩增板、96孔PCR扩增板管盖、量筒、发芽盒、玻璃板、玻璃棒、一次性手套、一次性口罩。1DB43/T281220235试剂配制相关试剂配制方法见附录A6引物部分SSR引物信息见附录B7鉴定流程种子催芽种子扦样参考GB/T3543.2。取丝瓜杂交种约250粒，父母本约各10粒，温汤浸种后，2830催芽至种子露出子叶。取样取发芽种子胚轴0.5cm1cm，用于DNA提取.DNA提取方法可采用CTAB小样法或者快速碱煮法提取。7.3.1CTAB小样法将丝瓜样品放于研钵中，加入0.8mLDNA缓冲液，研磨均匀，将磨好的样品倒回至2ml离心管，冰上
7、放置或者放冰箱冷冻。将研磨好的样品放置于48孔板架上，60水浴30min，中间每隔5min摇一次，使样品受热均匀。取出管架，打开2mL离心管管盖，然后加入0.8mL氯仿:异戊醇（24:1）溶液，颠倒混匀。室温下静置5cm10min后10,000rpm离心5min；将上清仔细移至另一2mL离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温静置3min，5,000rpm离心5min，去除上清。用70%的乙醇洗涤沉淀2次，待乙醇全部风干后，加入500L60预热的ddH2O，再加入5LRNaseA(10g/l)，37温浴10min，最后加入1/10体积的3mol/LNaAc及2体积的冰乙醇，混匀，-20放置20m
8、in。5,000rpm离心5min，去上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2次，风干乙醇后加入200LddH2O。用紫外分光光度计检测DNA浓度并将DNA溶液用ddH2O稀释到20ng/L，-20冰箱中保存备用。7.3.2快速碱煮法将丝瓜胚轴放入96孔PCR板管底部，并加入0.25mol/L的NaOH溶液50L，用96孔板盖盖好PCR板，置于沸水中煮3min，最后加入0.1mol/L的TrisHCl(pH=8.0)150L。PCR扩增7.4.1扩增体系DNA模板约0.5L，10Buffer1L，10mmol/ldNTP0.1L，10pmol/lSSR引物0.2L，2.5U/lrTaq0.1L，加灭菌d
9、dH2O至总体积10L。7.4.2反应程序2𝑁𝑁1100%(1)DB43/T2812202394预变性4min，94变性30s，58退火30s，72延伸30s，共30个循环，最后72延伸5min，4保存。电泳检测PCR结束后，在每孔中加入2L6加样缓冲液，混匀，置于4冰箱待检测。对于扩增条带大小差别不大的扩增产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，扩增条带大小差别较大的扩增产物宜采用普通琼脂糖凝胶电泳。7.5.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳7.5.1.1电泳装置准备将玻璃板清洗干净，盖上凹槽玻璃板。利用琼脂糖凝胶封好玻璃板。将封胶好的玻璃板放在电泳槽中，将电泳槽的正极和负极分
10、别与电泳仪连接。7.5.1.2灌胶将现配的8%丙烯酰胺（PAGE）凝胶，轻轻摇匀，缓缓灌入玻璃胶室，胶灌满整个胶室后，插入样品梳，室温下聚合90min。胶完全聚合后，加入0.5TBE电泳缓冲液，拔出样品梳。7.5.1.3点样与电泳检测每个PCR扩增产物中加2L6加样缓冲液，充分混匀后，每个加样孔加入3L样品，并设置标准分子量DNA作片段大小标准。180V恒压电泳90min左右。7.5.1.4染色、显色和拍照电泳结束后，将凝胶放在专用盆中，加入500ml蒸馏水清洗2遍3遍后，放入染色液中，染色3min5min，取出胶板，用蒸馏水漂洗2次3次。将胶板放入盛有400mL显影液的托盘中，轻轻摇动至条带
11、清晰后，迅速用蒸馏水漂洗3遍5遍，将胶用保鲜膜包好，置于胶片观察灯上，观察带型并拍照记录。7.5.2普通琼脂糖凝胶电泳将PCR产物与2L6加样缓冲液混合，点样至1.0%3.0%的琼脂糖凝胶点样孔内（含有0.5g/ml的溴化乙锭或者其它指示剂），同时设置标准分子量DNA作片段大小标准，在1TAE缓冲液中进行凝胶电泳，电泳电压120V，电泳时间约30min，并在凝胶成像系统控制软件上观察记录PCR扩增条带。8纯度计算SSR扩增条带表现双亲带型，则为杂交种；表现任一亲本带型或者其他带型，则为假杂种。分别统计杂交种和假杂种的样品数量，根据式(1)计算杂交种纯度。𝑃𝑃=&
12、#119873;𝑁1𝑁𝑁2式中：𝑃𝑃代表杂交种纯度𝑁𝑁1代表检测总数𝑁𝑁2代表非杂交种谱带类型的个体数量3DB43/T281220234DB43/T28122023AA附录A（资料性）常用试剂配方A.1DNA提取试剂A.1.10.5mol/LEDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）（pH8.0）溶液称EDTA186.1g，加入已有800ml双蒸水的烧杯中，用氢氧化钠调节pH值至8.0，补双蒸水至1000ml，用玻璃棒搅拌、摇匀，分装至100ml的玻璃瓶中，高压蒸
13、汽灭菌（121，20min）后，置于4冰箱中保存备用。A.1.21mol/LTris-HCl（三羟基氨基甲烷盐酸，pH8.0）溶液称121.1gTris加入含有800ml双蒸水的烧杯中，用盐酸调节pH值至8.0，补双蒸水定容至1L，摇匀，4冰箱中保存备用。A.1.3DNA提取液取1mol/LTris-HCl溶液50ml、0.5mol/LEDTA溶液20ml，称SDS7.5g和氯化钠14.6g加入到500ml烧杯中，用双蒸水定容至500ml，充分混匀，使得溶液中的最终浓度为TrisHCl100mmol/L，EDTA20mMol/L，NaCl500mmol/L，SDS1.5%（v/v）。A.1.4
14、氯仿:异戊醇:乙醇（80:4:16）取160ml三氯甲烷，8ml异戊醇和32ml乙醇加在一起混匀，4冰箱保存备用。A.1.50.25mol/L的NaOH称取NaOH1g，加入双蒸水定容至100ml。A.1.60.1mol/L的TrisHCl取1mol/LTris-HCl（pH8.0）10ml，加双蒸水定容至100ml。A.2PCR扩增试剂PCR扩增所用的dNTP，TaqDNA聚合酶均从试剂公司（北京全式金生物技术有限公司）购买，-20保存备用。引物委托上海生工生物工程公司合成，并将合成后的正向和反向引物用灭菌的双蒸水配置成100M的储存液，从中取10l加90l双蒸水配置成10M的工作液，-20
15、保存备用。A.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂A.3.110TBE缓冲液称取108gTris，55g硼酸，40ml0.5MEDTA(pH8.0)，加入烧杯中，用双蒸水定容到1L，摇匀。A.3.210%（W/V）过硫酸铵溶液（APS）称0.1g过硫酸铵，加入1ml双蒸水，混匀，现配现用（保质期48h）。5DB43/T28122023A.3.31TBE缓冲液取10TBE缓冲液200ml，加双蒸水1800ml，摇匀。A.3.41TAE缓冲液取10TAE缓冲液200ml，加双蒸水1800ml，摇匀。A.3.56加样缓冲液称取溴酚蓝0.25g，二甲苯青0.25g，加98ml甲酰胺溶液和2mlEDTA（pH8
16、.0）溶液溶解，混匀，-20保存备用。A.3.68%PAGE（丙烯酰胺）凝胶40%PAGE8ml、10TBE4ml、ddH2028ml、10%AP400l、TEMED20l，总体积40ml，实践中可根据垂直板的大小按比例配置凝胶。A.4银染、显影试剂A.4.1染色液称1.5g硝酸银，加双蒸水1000ml溶解，再加1.5ml甲醛混匀。A.4.2显影液称15g氢氧化钠，加入1000ml双蒸水溶解，再加7.5ml甲醛，混匀。6引物编号5-3正向引物序列3-5正向引物序列S01CTCCCTCTTTCCCTCACTCCGACAGGACCGTTAACCCAAAS02TAAATACCCGCCTCGAACAC
17、TCCATCCCAGATTTTGCTTCS03GGGAGAACAAGATAGCCCAATGCAAACTTCGATTTGCTCAS04CAGCTCTACAACAACATCTCATCATTGGATGTGGGATTCTCS05AAGATTGAAGTGGGAAAATGCGGCAATCATCTTATCTTTCS06TGGAGTGTTGACATTGTTTTCAGGTTGGAGTAAGCCAAATTACAS07TTGAAGATGAAGCCGGAGTTCTAGAGTCAGATGCCTCGCCS08AGAATAAGGTCCACATAAGGGTTAAAGGCTATGGTATAGAACS09CAGCTCTACAAC
18、AACATCTCATCCAACTCGACCAAGAAACS10ACTCAATCCAACCCACGAATAGTGGCATTTGAACGCTAAGTTGS11TTCGCCTCAGTCCATCTAGTTTATGTCGTACCTTTTCCCCTTTTS12TTTGAATCTCGCCATGAAGCTACCCTGTTTTGCAGCTACGS13CTCCTCAAGAAAATCCACTTCCCCAGGTAATTCTCCTCCATGTCS14TATTGCCCCAAACTCTTCTCTCATGGACAAAACTTCATAACGCCS15TTCGCCTCAGTCCATCTAGTTTATGTCGTACCTTTTCCC
19、CTTTTS16TTCCCCATCCATACATTTCTTCCCCTCTCTTCTCCATTTTCTCAS17GGCGGAATACAAGAAAGATACCCATGTGAAAAGGGAACAGAGAAS18CCAACTATCACCCCTACAATCAGGACAGAACCTAAAAGAAAGAAGAGS19GTCTTCCTGAGAGCTTTTGCATCCCTCTTCTCCTTCGATCTTCTS20AACCTCTCGTCATTACTACCGCGTGACTAAAAGCGTGTGAGTGGS21CGTTTGAGATGTGTGCATGTAGTTAAGAGACTGGTTGGAGTTGAGAS22TACCT
20、TCACCCAACTCGCTATTGTGTGTGTTTGATCGGCTGTTS23TTTGTTCTATTCCCCTCTTCCATCGATTACGACGACTTTCTTGAS24TCAGGAAGTGGAGACAACACCGGGAAAAGACTGCACCATCAS25GCTCTCGATTCTAACCAAAACCTCATTCTACCTCTCCAATTCCAS26ACATTTTCACTAGCAGAAGGGGGTGCCCATGTATAGGAAGCAAS27GAAAGAAGGCGAGGAGTGTAGAGAAAAGGAAAGTTGGGGTGTTTS28TTTGGGCTCTGACATTAGATGAACACCT
21、TTGGGAGATAACAAGCS29CTCCAAGGAAGAAGAAGAAACCAATACTGCCACATCATCAGCTCS30GGAGGAGGGAAGAGGAGATGAGGTAAAGCAACAACCCCATAAS31GTCGCCACCGTTGAGTTTAACCTTAATCCGGCTAGGAAAGDB43/T28122023BB附录B（资料性）引物信息表B.1给出了部分引物信息，更多引物设计请参考国际葫芦科基因组网站（http:/www.icugi.org）公布的信息。表B.1部分SSR引物信息7引物编号5-3正向引物序列3-5正向引物序列S32CATCACCACCACCACAACCGCC
22、ACCAAAATCAGCTCTATGS33AGAAGTGGGAGATTGAACATGCGTTGGTATGTGAACCTTGAGGCS34TCCACCAACTCTCACTTTCCTTGCATATCCCCAAAACGAACTAAS35AAGACAAATTAAGGAGGGGAGGTAAGACGAGCGTAATGGTTGACS36TTCTTTCTCCTTCGCTGTCTTCGGGATGATGATATTCGGAGCTAS37CCACCCCATTTCATACACAATACATTCAACCTAAGAGCGAGTGAS38AATTTTATGGACCTCATTCCCCTTTACCAAACCCAATTCTAGCC
23、S39GTTTGTTGGAATTAGGGTGGAGCTTTGGGAGGAGATTGATTTTGS40TACCGATGCTCTGTTCTTGCTATTCCCACTTCATTGTCCAAAGTS41TGAGAGAGAAACATTGGGACCTATGAGAGATTTGACTTGGGGAAS42TGGCTAATTGGGTGAGCTACAGTGGTGGAAGTGTTACTGTGTGTGS43CTAGCCACCTCTGATATGCAACGTCCTACCCCTTATGACTATTTTGTS44AACATGGGATAAAACGGACATCAGTTGCCGCTGTTTGAGTAAGTS45AACAAACGCATAGGAGAAGAGCTCAGGGGAAACTGATTTATTGCS46CAATCTCAAACCCAAGTTCCAGAACAGAATGGTGAGGCAGATGS47ACTATAAGAACGTGCAGGCCATGAAGAAAGCTAATGTTGGTCGGS48GGGCTTCACCACACATTTCTGAACAAGGGAAGATTTAGGTCAACS49TATAATGGTCCCACTGAAAGCCCATTCCAGCACCTACAGCTTCS50TATAATGGTCCCACTGAAAGCCCATTCCAGCACCTACAGCTTCDB43/T28122023表B.1部分SSR引物信息（续）8