《DB43_T 959.2-2023 异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogen Free, DPF）医用供体猪 第2部分：微生物、寄生虫学等级与监测.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DB43_T 959.2-2023 异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogen Free, DPF）医用供体猪 第2部分：微生物、寄生虫学等级与监测.docx（31页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、ICS70.080CCSB4443湖南省地方标准DB43/T959.22023代替DB43/T959.22014异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogenFree,DPF）医用供体猪第2部分：微生物、寄生虫学等级与监测MedicalgradeDPFdonorpigforxenotransplantationPart2:mircrobiologicalparasitologicalstandardsandsurveillance2023-11-09发布2024-02-09实施湖南省市场监督管理局发布DB43/T959.22023目次前言引言1范围12规范性引用文件13术语和定义
2、14微生物学等级35检测要求36检测程序37检测方法38检测规则59结果判定610判定结论611样本保存6附录A（规范性）牛分枝杆菌PCR检测方法7附录B（规范性）细胞内鸟型分枝杆菌PCR检测方法8附录C（规范性）新型隐球菌DNA实时荧光定量PCR检测9附录D（规范性）抗荚膜组织胞浆菌抗体ELISA检测方法10附录E（规范性）猪兰氏类圆线虫病镜检法诊断11附录F（规范性）布氏姜片吸虫镜检法诊断12附录G（规范性）猪脑心肌炎病毒间接ELISA检测13附录H（规范性）人流感病毒多重PCR检测14附录I（规范性）猪巨细胞病毒FQ-PCR检测15附录J（规范性）疱疹病毒核酸检测17附录K（规范性）猪急
3、性腹泻综合征冠状病毒（SADSCoV）RTPCR检测19附录L（规范性）猪呼吸道冠状病毒（PRCV）巢式PCR检测20附录M（规范性）猪血凝性脑脊髓炎病毒检测21附录N（规范性）猪内源性逆转录病毒C（PERV-C）PCR检测24附录O（规范性）猪嗜淋巴细胞疱疹病毒3型TaqMan荧光定量PCR检测25附录P（规范性）新型冠状病毒肺炎防控方案（第七版）26IDB43/T959.22023前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是DB43/T959异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogenFree,DPF）医用供体猪
4、的第2部分。DB43/T959已发布了以下部分：第1部分：遗传质量控制；第2部分：微生物、寄生虫学等级与监测；第3部分：配合饲料；第4部分：病理学诊断规范；第5部分：环境与设施。本文件替代DB43/T959.22014异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogenFree,DPF）医用供体猪第2部分：微生物学等级与监测，与DB43/T959.22014相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a）将本文件“标题”由“异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogenFree,DPF）医用供体猪第2部分：微生物学监测”更改为“异种移植用无指定病原体（Designa
5、tedPathogenFree,DPF）医用供体猪第2部分：微生物、寄生虫学等级与监测”；b）增加了“引言”一章；c）增加猪圆环病毒1型、猪冠状病毒、猪内源性逆转录病毒、猪淋巴性疱疹病毒、戊型肝炎病毒、新型冠状病毒的检测及检测方法（见7，2014版的7）；d）更改了“检测频率”（见8.1，2014版的8.1）；e）更改了“表2抽样数量”（见8.2.2，2014版的8.2.2）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖南省科学技术厅提出并归口。本文件起草单位：中南大学湘雅三医院，湖南赛诺生物科技股份有限公司。本文件主要起草人：王维、罗敏华、李桑、蔡亮、
6、胡鹏志、马小倩、徐畅、王佳、石兴勇。本文件及其所替代文件的历次版本发布情况为：2014年首次发布为DB43/T959.22014；本次为第一次修订。IIIDB43/T959.22023引言异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogenFree,DPF）医用供体猪标准化能更好的促进异种细胞、组织和器官移植相关产业发展，有利于湖南省政府部门行政审批和监管工作的实施。为了保证异种移植用无指定病原体医用供体猪研发、生产和应用的稳定、高效进行，对其进行标准化管理已成为首要任务。在这方面，湖南省已建立了异种移植用无指定病原体医用供体猪基础性地方标准体系。在该体系中，DB43/T959异种移植
7、用无指定病原体（DesignatedPathogenFree,DPF）医用供体猪是指导湖南省异种移植用无指定病原体医用供体猪培育的基础性和通用性的标准。DB43/T959旨在确立普遍适用于标准化异种移植用无指定病原体医用供体猪遗传质量控制、微生物检测、饲料、病理学检测、环境设施的准则，拟由五个部分构成。第1部分：遗传质量控制。目的在于维持异种移植用无指定病原体医用供体猪遗传质量稳定性。第2部分：微生物、寄生虫学等级与监测。目的在于保证异种移植用无指定病原体医用供体猪生物安全性。第3部分：配合饲料。目的在于保障异种移植用无指定病原体医用供体猪饲料的安全和营养。第4部分：病理学诊断规范。目的在于标
8、准化异种移植用无指定病原体医用供体猪病理学检测内容和方法。第5部分：环境与设施。目的在于标准化异种移植用无指定病原体医用供体猪环境条件控制和设施建设。异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫学监测是决定异种移植成功与否的关键性因素之一。为了做好这项工作，湖南省在2014年发布了有关异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫学监测的地方标准。DB43/T959.2发布实施已九年，这期间国际异种移植领域取得了突破性成果，异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫学监测受到越来越广泛的重视，与微生物、寄生虫监测有关的理论研究和实践都发生了变化。首先，世界卫生组织于2018年在湖南省长沙
9、市召开了“第三届全球异种移植临床研究规范研讨会”，对异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫检测项目和方法进行深入探讨。其次，在DB43/T959.2的广泛应用以及实践期间，非洲猪瘟病毒、新型冠状病毒等席卷中国，对异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫学监测项目和内容产生了新的需求与建议。鉴于此，确有必要修订完善DB43/T959.2，以不断监测国内外猪流行性疾病的新变化，确保高质量、高安全性异种移植用无指定病原体医用供体猪的稳定发展。对异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫学监测进行标准化，首先需要排除已知和潜在的引起异种移植跨种系感染风险微生物；其次是应根据近几年猪流
10、行性疾病调查，及时更新病原体检测内容与方法，以保证异种移植用无指定病原体医用供体猪稳定发展。本次对DB43/T959.2的修订，重点考虑了异种移植跨种系感染微生物和最新猪流行性疾病病原体检测，通过排除异种移植用无指定病原体医用供体猪微生物、寄生虫感染风险，保障异种移植用无指定病原体医用供体猪安全性，进一步提高异种移植的成功率，从而全面提升我国异种移植发展水平。VDB43/T959.22023异种移植用无指定病原体（DesignatedPathogenFree,DPF）医用供体猪第2部分：微生物、寄生虫学等级与监测1范围本文件规定了异种移植用无指定病原体（DesignedPathogenFree
11、,DPF）医用供体猪微生物学等级分类、检测要求、检测程序、检测方法、检测规则、结果判定、判定结论、样本保存等。本文件适用于异种移植用DPF医用供体猪微生物学等级监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T14926.1实验动物沙门菌检验方法GB/T14926.4实验动物皮肤病原真菌检测方法GB/T14926.8实验动物支原体检测方法GB/T14926.27实验动物小鼠腺病毒检验方法GB/T14926.30实验动物兔轮状病毒检测
12、方法GB/T14926.46实验动物钩端螺旋体检测方法GB/T14926.47实验动物志贺菌检测方法GB/T14926.48实验动物结合分枝杆菌检测方法GB/T14926.56实验动物狂犬病病毒检测方法GB/T16551猪瘟诊断技术GB17013包虫病诊断标准及处理原则GB/T18090猪繁殖与呼吸综合征诊断方法GB/T18448.1实验动物体外寄生虫检测方法GB/T18448.2实验动物弓形虫检测方法GB/T18448.6实验动物蠕虫检测方法GB/T18648非洲猪瘟诊断技术GB/T18638流行性乙型脑炎诊断技术GB/T18641伪狂犬病诊断技术GB/T18646动物布鲁氏菌病诊断技术GB
13、/T18647动物球虫病诊断技术GB/T18935口蹄疫诊断技术GB/T19200猪水泡病诊断技术GB/T19915.1猪链球菌2型平板和试管凝集试验操作规程1DB43/T959.22023GB/T19915.2猪链球菌2型分离鉴定操作规程GB/T19915.3猪链球菌2型PCR定型检测技术GB/T19915.7猪链球菌2型荧光PCR检测方法GB/T21674猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法GB/T22333日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法GB/T22915口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法GB/T22917猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法GB/T27517鉴别猪繁殖与呼吸综合征病
14、毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法GB/T27536猪流感病毒分离与鉴定方法GB/T21674猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法GB/T34757猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法GB/T35912猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法GB/T36871猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法NY/T537猪传染性胸膜肺炎诊断技术NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T545猪痢疾诊断技术NY/T546猪传染性萎缩性鼻炎诊断技术NY/T548猪传染性胃肠炎诊断技术NY/T550动物和动物产品沙门氏菌检测方法NY/T564猪巴氏杆菌病
15、诊断技术NY/T679猪繁殖和呼吸综合症免疫酶试验方法SN/T0420出口猪肉旋毛虫检验方法磁力搅拌集样消化法SN/T1379.1猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验SN/T1396弓形虫病检疫技术规范SN/T1446.1猪传染性胃肠炎阻断酶联免疫吸附试验SN/T1699猪流行性腹泻检疫技术规范SN/T1919猪细小病毒病检疫技术规范SN/T2708猪圆环病毒病检疫技术规范SN/T3499新孢子虫病检疫技术规范SN/T4235猪戊型肝炎检疫技术规范SN/T5124猪Delta冠状病毒检疫技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。异种移植用DPF医用供体猪medicalgradeDPFdonor
16、pigforxenotransplantation经人工饲养与培育，遗传背景明确或者来源清楚，12月龄体重宜不超过50kg，不携带世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）指定供体动物应排除的潜在感染或条件致病和感染性人畜共患疾病病原，必须利用生物安全屏障环境防止病原体感染，不得使用抗生素或疫苗，用于医用异种移植供体、科学研究、教学、生产和质量控制鉴定以及其他科学实验的小型猪。2DB43/T959.220234微生物学等级异种移植用DPF医用供体猪微生物学等级为医用供体无指定病原体级。5检测要求5.1临床观察外观检查无异常。5.2微生物检测项目异种移植用DPF医用供
17、体猪病原微生物检测项目见表1。6检测程序检测程序见图1。图1异种移植用DPF医用供体猪检测程序结合临床症状和实验室检查结果，需要进一步确证时，可取特定样本进行检测。7检测方法检测方法见表1。3类型序号检测项目检测方法细菌类Bacterium1布鲁氏菌BrucellasppGB/T186462钩端螺旋体LeptospirasppGB/T14926.463猪痢疾蛇样螺旋体SerpulinahyodysenteriaeNY/T5454牛型分枝杆菌Mycobacteriumbovis附录A5结核分枝杆菌MycobacteriumtuberculosisGB/T14926.486细胞内鸟型结核分枝杆菌复
18、合物Mycobacteriumavium-intracelluarecomplex附录B7猪肺炎支原体MycoplasmahyopneumoniaeGB/T14926.88沙门氏菌SalmonellatyphiGB/T14926.1；NY/T5509志贺氏菌ShigellaGB/T14926.4710支气管败血波氏杆菌BordetellabronchisepticaNY/T54611多杀巴氏杆菌PasteurellamultocidaNY/T546；NY/T56412猪胸膜肺炎放线杆菌ActinobacilluspleuropneumoniaeNY/T53713猪链球菌2型Streptococ
19、cussuistype2GB/T19915.1-3；GB/T19915.7真菌类Fungi14皮肤病原真菌PathogenicdermalfungiGB/T14926.415新型隐球菌Cryptococcusneoformans附录C16www.bzfxw.荚膜组织胞浆菌Histoplasmacapsulatum附录D寄生虫类Parasites17体外寄生虫EctozoaGB/T18448.118猪蛔虫AscarissuumGB/T18448.619棘球绦虫Echinococcussp.GB1701320等孢球虫属IsosporaspGB/T1864721猪兰氏类圆线虫Strongyloide
20、sransomi附录E22弓形虫ToxoplasmagondiiGB/T18448.2；SN/T139623旋毛虫TrichinellaspiralisSN/T042024新孢子虫NeosporaSN/T349925布氏姜片吸虫Fasciolopsisbuski附录F病毒类Viruses26猪腺病毒Adenovirus(porcine)GB/T14926.2727猪脑心肌炎病毒Encephalomyocarditisvirus附录G28猪流感病毒porcineInfluenzavirusGB/T2753629人流感病毒HumanInfluenzaviruses附录H30猪巨细胞病毒Porcin
21、ecytomegalovirus附录I31疱疹病毒Porcinegama-herpesvirus附录J32猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株PorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusGB/T27517DB43/T959.22023表1异种移植用DPF医用供体猪病原微生物检测项目及检测方法4类型序号检测项目检测方法病毒类Viruses33猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株PorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusGB/T3591234猪细小病毒ProcineparvovirusSN/T191935轮状
22、病毒RotavirusGB/T14926.3036伪狂犬病病毒PseudorablesvirusGB/T1864137狂犬病病毒RabiesvirusGB/T14926.5638口蹄疫病毒FootandmouthdiseasevirusGB/T18935；GB/T2291539猪瘟病毒ClassicalswinefevervirusGB/T16551；SN/T1379.140日本乙型脑炎病毒JapanesesencephalitisvirusGB/T18638；GB/T2233341猪圆环病毒1型Porcinecircovirustype1GB/T21674；SN/T270842猪圆环病毒2型
23、Porcinecircovirustype2GB/T21674；SN/T270843猪传染性胃肠炎病毒PorcinetransmissiblegastroenteritisvirusGB/T36871；NY/T548；SN/T1446.144猪流行性腹泻病毒PorcineepidemicdiarrheavirusGB/T36871；GB/T34757；SN/T169945猪德尔塔冠状病毒PorcinedeltacoronavirusSN/T512446猪急性腹泻综合征冠状病毒Swineacutediarrheasyndromecoronavirus附录K47www.bzfxw.猪呼吸道冠状病毒
24、PorcineRespiratoryCoronavirus附录L48猪血凝性脑脊髓炎病毒Porcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus附录M49猪水泡病病毒SwinevesiculardiseasevirusGB/T19200；GB/T2291750猪内源性逆转录病毒CPorcineendogenousretrovirusC(PERV-C)附录N51猪淋巴性疱疹病毒Porcinelymphotropicherpesvirus(PLHV)附录O52戊型肝炎病毒HepatitisEvirus(HEV)SN/T4235-201553新型冠状病毒Severe
25、AcuteRespiratorySyndromeCoronavirus2（SARS-CoV-2）附录P54非洲猪瘟病毒DiagnostictechniquesforAfricanswinefeverGB/T18648DB43/T959.22023表1异种移植用DPF医用供体猪病原微生物检测项目及检测方法（续）8检测规则8.1检测频率每3个月至少检测一次。8.2抽样8.2.1方式选择3月龄以上的异种移植用DPF医用供体猪用于检测，随机抽样。5群体大小抽样数量50头不少于3头50-100头不少于5头100-500头不少于10头500头不少于25头注：临床用猪需要进行100检测。DB43/T959.
26、220238.2.2数量根据异种移植用DPF医用供体猪群体大小，抽样数量见表2。表2抽样数量8.2.3方法8.2.3.1按病毒、细菌、真菌、寄生虫检测要求联合采样。8.2.3.2采样方法按照NY/T541以及医学采样程序进行。8.3样本标识要求样本要求有明显标识，写明检品名称、品系、等级、数量、编号、栏舍及检测项目等内容，安全送达实验室。9结果判定9.1合格判定按各个微生物检测项目结果判定方法判定检测结果，抗体检测项目，血清抗体阴性为合格；抗原和核酸检测项目，未见阳性为合格。如果PCR出现阳性需进行测序验证，相似度达90以上判定为阳性。10判定结论所有项目的检测结果均合格，判为符合DPF等级标
27、准。否则，判为不符合DPF等级标准。11样本保存11.1样本资料、样本来源、动物编号、样本种类及编号，按医学病理资料档案管理规范保存。保存时间为1年。11.2检测样本应一式两份，其中一份应该保存于液氮罐中，保存器具应该标志清晰，符合病理标本保存规范。6DB43/T959.22023附录A（规范性）牛分枝杆菌PCR检测方法A.1原理以牛分枝杆菌16SrRNA基因和IS6110基因为靶序列，建立双重PCR方法。A.2样品采集A.2.1样品类型健康样本A.2.2样品采集用无菌剪刀剪取病料组织约0.5-1g，置无菌1.5mLEP管中；加入400L的组织消化液和蛋白酶K（终浓度为lmg/mL）；55，水
28、浴8h，其间间隔半小时颠倒EP管几次，以使病料组织与消化液充分反应；8000rpm，离心5min，取上清液置另一无菌1.5mLEP管中；加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：l）液体，反复颠倒几次；l2000rpm，离心10min，取上层液体于一无菌1.5mLEP管中；重复抽提1次；加入等体积的异丙醇，充分混匀后，置-2030min；12000rpm，离心10min，弃上清；沉淀用70乙醇清洗，并置37，至乙醇挥发完全；加入30LTE，并加入RNA酶，37，放置40min；将所得液体作为模板，并置-20保存。A.3操作步骤A.3.1引物的设计参照MycobacteriumbovisAF2
29、122/97gi:31742509基因序列设计出16SrRNA基因和IS6110基因引物。引物序列如下：16SrRNAP1:5-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-316SrRNAP2:5-GCCCGTATCGCCCGCACGCT-3扩增片段大小约为584bp。IS6110P1:5-GGCTTGCCGGGTTTGA-3IS6110P2:5-TTTGTCACCGACGCCTACGCT-3扩增片段大小约为309bp。A.3.2PCR反应L根据引物设计时，oligo6.0软件提供的建议Tm值，PCR反应体系为：原理模板2（1.75pg-1.75g），10PCRbuffer2.5L，dNT
30、Ps2L，IS6110引物各0.5L（5pM），16SrRNA引物各1.5L（15pM），蒸馏水14L，Taq酶0.5L（2.5U）；体系总体积为25L。PCR扩增的反应条件：95预变性10min，95变性30s，59.5退火30s，72延伸45s，30个循环，最后延伸7min，4保存。A.3.3PCR扩增产物的鉴定0.8的琼脂糖，电压120V，电泳12-15min，在凝胶成像系统中检测。A.4结果判定按照设定的双重PCR反应体系和扩增条件，如果出现大小309bp的IS6110基因和约584bp的16SrRNA基因的目的片段说明PCR结果阳性。7DB43/T959.22023附录B（规范性）细
31、胞内鸟型分枝杆菌PCR检测方法B.1以鸟型分枝杆菌特异性插入序列IS1245，设计一对特异性引物，用于检测和鉴定皮肤组织中鸟型分枝杆菌。B.2样品采集B.2.1样品类型猪皮肤组织B.2.2样品采集无菌条件下取上述组织1g左右，置入1.5mL洁净EP管。B.3操作步骤B.3.1组织处理将皮肤组织去脂、剪碎，用组织研磨器研磨后补加适量蒸馏水，制成组织匀浆2mL，低速离心后取上清液，2倍连续稀释后装于微量离心管中。B.3.2PCR扩增和检测扩增插入序列IS1245：引物1为5-GCCGCCGAAACGATCTAC-3引物2为5-AGGTGGCGTCGAGGAAGAC-350LPCR反应体系含10PC
32、R缓冲液5L，25mmol/LMgCl25L，dNTPs200mol/L，引物各1mol/L，模板DNA10L，TaqDNA聚合酶1U。循环条件：94预变性5min，其后按9430s，6530s，7245s，扩增产物于1.5琼脂糖凝胶电泳，花青素染色，用紫外检测仪观察结果并摄影。B.4结果判定。出现427bp扩增带为阳性，未见427bp扩增带为阴性。8DB43/T959.22023附录C（规范性）新型隐球菌DNA实时荧光定量PCR检测C.1以新型隐球菌的ITS基因序列中一段高度保守序列为目的序列，设计出特异引物和探针，应用实时荧光定量PCR技术进行检测。C.2样品采集C.2.1样品类型猪肺部分
33、泌物C.2.2样品采集对送检的猪解剖后用棉拭子取下肺部的分泌物，用PBS洗脱棉拭子，洗下的液体经冻融三次，离心取上清，加入双抗保存备用。C.3操作步骤C.3.1引物的设计根据新型隐球菌的基因序列设计引物为：FP:5-TTACCTGTTGGACTTGGATTTGG-3RP:5-CATAGGCCCAGCGAAACTTATT-3C.3.2DNA的提取取气管分泌物上清加入SDS和蛋白酶K，50水浴1h，每15分钟摇一次。用酚及酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用20ul无菌双蒸水溶解备用。在反应体系中加入5ul模板，总量为50uL。C.3.3目的基因的扩增以50LPCR反应体系进行反应：10PCRBuffer（含15mmol/LMgCl2）5L，dNTPmixture（10mol/L）1L，TaqDNA聚合酶（5U/L）0.4L、DNA模板2L，上下游引物各3L，加ddH2O至50L，于扩增仪扩增，循环条件：945min，9430s、581min共40