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1、考点三基因工程及生物技术的安全性与伦理问题1基因工程的理论基础2基因工程的3种基本工具3.熟记基因工程的四个操作步骤4图解记忆蛋白质工程5PCR技术原理与条件6PCR技术的过程7DNA的粗提取与鉴定8DNA片段的电泳鉴定9治疗性克隆与生殖性克隆的关系类型项目治疗性克隆生殖性克隆区别目的利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用于医学研究和治疗利用克隆技术产生独立生存的新个体，获得人的复制品水平细胞水平个体水平联系都属于无性生殖；产生的新细胞、组织、器官或新个体，遗传信息相同10.区分试管婴儿和设计试管婴儿(1)设计试管婴儿比试管婴儿多出的是过程(遗传学诊断)。(2)试管婴儿主要解决不孕夫妇的生
2、育问题，设计试管婴儿用于白血病、贫血症等疾病的治疗。(3)两者都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。1(2022山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是()A过滤液沉淀过程在4 冰箱中进行是为了防止DNA降解B离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D粗提取的DNA中可能含有蛋白质答案B解析低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋
3、白质不溶于酒精，在体积分数为95%的冷酒精中与DNA一块析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。2(2020江苏，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoR酶切为例)：请据图回答问题：(1)步骤用的EcoR是一种 酶，它通过识别特定的 切割特定位点。(2)步骤用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3羟基与5磷酸间形成 ；PCR循环中，升温到95 是为了获得 ；Taq DNA聚合酶的作用是催化 。(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤选用的PCR引物必须是 (从引物中选择，填编号)。DNA序列(虚
4、线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物5AACTATGCGCTCATGA35GCAATGCGTAGCCTCT35AGAGGCTACGCATTGC35TCATGAGCGCATAGTT3(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是 。A5AACTATGCGAGCCCTT3B5AATTCCATGCTGAATT3C5GCAATGCGTTCGGGAA3D5TTGATACGCCGAGTAC3答案(1)限制性内切核酸(或限制)核苷酸序列(2)磷酸二酯键DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸(3)(4)B解析(3)PCR过程中，
5、根据已知的DNA序列合成两个引物，要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合，该引物是，另一个引物是与已知DNA序列的第二条链的右端互补结合，该引物是。(4)图中由片段F形成的环状DNA的未知序列中有一个EcoR限制酶的切割位点，而EcoR识别的位点是，因此片段F的单链中的一端应含有“AATTC”序列，另一端应含有“TTAAG”序列，B符合题意。3(2021江苏，23)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白
6、M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：(1)目的基因的扩增提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致 。热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加热到80 以上再混入酶，然后直接从94 开始PCR扩增，下列叙述正确的有 。ATaq酶最适催化温度范围为5060 B与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物C两条子链的合成一定都是从5端向3端延伸DPCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特
7、异性(2)重组质粒的构建将Sma切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进 ，形成Am结合体。将Am结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等，完成质粒的环化。若正确构建的重组质粒Am仍能被Sma切开，则Sma的酶切位点可能在 。(3)融合蛋白的表达用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒Am，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。若通过抗原抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明 ，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。答案(1)RNA蛋白M上不含tag标签BC(2)黏性
8、末端碱基配对DNA连接基因m的连接处、基因m的内部(3)受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落融合基因表达(或融合基因正确解码)解析(1)逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。由题干信息“80 以上再混入酶，然后直接从94 开始PCR扩增”可知，Taq酶最适催化温度范围为94 左右，A错误；PCR 反应的最初加热过程中，
9、样品温度上升到70 之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性，热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确；DNA分子复制具有方向性，都是从5端向3端延伸，C正确；TaqDNA聚合酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶更耐高温，D错误。故选BC。(2)从图上看，载体A只有一个Sma 的酶切位点，故被Sma 切开后，载体由环状变为链状DNA，将Sma 切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源
10、序列的m的黏性末端碱基互补配对。将Am结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。重组质粒中，载体A被Sma 切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒Am仍能被Sma切开，则Sma的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。(3)筛选目的菌株的机理：导入了质粒Am的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。若通过抗原抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，位于tag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达(或融合基因正确解码)。思维延伸判断与填充(1)某实验利用PC
11、R技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，可以提高复性的温度(2021湖北，16)()(2)(2018江苏，32节选)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。(3)(2022山东，25节选)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、单链核酸。为使PCR产物能被限制酶切割，需在
12、引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的5端(填“3端”或“5端”)。(4)(2019江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是乙、丙。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是目的基因反向连接。(5)(2019全国 ，38节选)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是加热至90 以上。在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原
13、因是Taq DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。题组一基因工程1(2022江苏南通高三一模)如图1中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR 、BamH和Sau3A三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点，图2为某种基因表达载体的示意图(载体上的EcoR 、Sau3A的切点是唯一的)。请回答下列问题：(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接，理由是 。(2)图2中启动子的作用是 ，终止子的作用是 ，抗生素抗性基因的作用是 。(3)构建基因表达载体时，还需要用到DNA连接酶。常见的DNA连接酶有 DNA连接酶和 DNA连接酶，其中能连接平
14、末端的是 DNA连接酶。(4)若某人利用图2所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子(如图3所示)。这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ，原因是 。答案(1)Sau3A 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)RNA聚合酶的识别和结合部位使转录过程停止便于重组DNA分子的筛选(3)E.coliT4T4(4)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录解析(1)经BamH酶切后得到的黏性末端是GATC，与Sau3A酶切后获得的黏性末端相同，所以经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载
15、体被Sau3A酶切后的产物连接。(2)启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，与RNA聚合酶结合后，开始进行转录过程；终止子使转录过程停止；抗生素抗性基因表达后，则生物具有抗生素抗性，便于重组DNA分子的筛选。(4)在基因表达载体中，目的基因应位于启动子和终止子之间才能表达。甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录。2抗体分子含有两条短肽链和两条长肽链，科研人员将小鼠编码抗体(抗禽流感病毒HA抗原)可变区的基因片段与人编码抗体恒定区的基因片段整合，构建图1所示表达载体(Hind 等表示不同限制酶的切割位点，EcoR V的识别序列和切割位点是)，导
16、入中国仓鼠卵巢细胞后，筛选能够稳定表达的细胞株，成功获得大量嵌合抗体(图2)。请根据资料回答下列问题：(1)为构建人鼠嵌合抗体基因表达载体，需要对编码抗体不同片段的基因进行重组，为此需从分泌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取 ，经逆转录得到 用于PCR扩增，并分别与人抗体的恒定区DNA序列拼接。(2)在PCR反应体系中需加入模板、 、Taq DNA聚合酶、引物、缓冲液等，扩增过程中高温处理的目的是 。若利用PCR技术扩增某基因片段时消耗了126个引物分子，则该过程扩增了 次。(3)图1所示表达载体中除标注出的结构外还必须有 ，图中是 识别和结合的部位。构建该基因表达载体时，先将人抗体的长链、短链
17、基因部分序列分别与相应鼠抗体的可变区序列整合后插入到两个启动子的下游，这一过程需要用到多种限制酶，如获得鼠抗体长链可变区基因用 酶切；图中和用 (填“T4 DNA”或“EcoliDNA”)连接酶连接。(4)通过基因工程技术成功表达并组装出有生物学活性的嵌合抗体，该嵌合抗体的优点是 。答案(1)鼠抗体mRNA(或mRNA或鼠抗体可变区mRNA)鼠抗体cDNA(或cDNA或鼠抗体可变区cDNA)(2)4种脱氧核苷酸(4种dNTP)使DNA变性(使DNA两条链分开、获得DNA单链)6(3)复制原点RNA聚合酶Hind 和Kpn T4 DNA(4)减少发生免疫排斥反应解析(1)基因工程的第一步是目的基
18、因的筛选与获取，可以通过mRNA逆转录得到相应的DNA；从分泌鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取鼠抗体mRNA(或mRNA或鼠抗体可变区mRNA)，经逆转录得到鼠抗体cDNA(或cDNA或鼠抗体可变区cDNA)用于PCR扩增。(2)PCR是体外进行DNA复制的过程，在PCR反应体系中需加入模板、4种脱氧核苷酸(4种dNTP)、TaqDNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)、引物及缓冲液等；高温处理使DNA 变性，双链DNA解聚为单链，有利于DNA复制的正常进行，温度降低后DNA复性。扩增片段消耗126个引物，即合成了126条子链，设扩增n次，则2n22126，n6，即进行了6次扩增。(3)构建表达载
19、体时，质粒除了图示结构外还需有复制原点；由图可知，启动子是RNA聚合酶识别和结合位点，可以驱动相关基因转录。由图可知，为鼠抗体长链可变区基因，因此将经Hind 和Kpn双酶切，以获得相应的黏性末端。和经EcoR 切开，为平末端，用T4 DNA连接酶进行连接。(4)鼠抗体注射到人体会引起免疫应答，通过基因工程技术成功表达并组装出有生物学活性的嵌合抗体，能够减少免疫排斥反应的发生。题组二DNA片段的扩增及电泳鉴定3(2022江苏高三模拟)染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特异性核酸酶水解后去除染色质蛋白，对得到的DNA片段进行凝胶电泳，结果如图所示。若先将
20、染色质中的蛋白质去掉后用同样的非特异性核酸酶处理，则得到随机长度的DNA片段。据此分析，下列有关叙述错误的是()A凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来B染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用C构成核小体的基本单位是脱氧核糖核苷酸D在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关答案C解析凝胶中的DNA分子经染色后，对波长为300 nm的紫外光吸收性强，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，A正确；由图可知，染色质用核酸酶处理后，得到是部分水解的染色质，但若先将染色质中的蛋白质去掉后用核酸酶处理，则得到随机长度的DNA片段，说明染色
21、质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用，B正确；染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的，核小体的组成成分是蛋白质和DNA，其基本单位是脱氧核糖核苷酸和氨基酸，C错误。4如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图，其中引物14在含有目的基因的DNA上的结合位置如图甲所示，限制酶BamH 、EcoR 、Hind 在质粒上的识别位点如图乙所示。下列说法中错误的是()APCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物30个B若已经合成了图甲所示4种引物，应选择引物2和3扩增目的基因C过程中应使用限制酶BamH切割质粒D对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行灭菌处理，以防其污染环境答案B解析PC
22、R 技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n12(n为循环次数)，因此PCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物241230(个)，A正确；由于DNA聚合酶只能从5端3端延伸子链，因此扩增目的基因时应选择引物1和4，B错误；是基因表达载体的构建过程；若使用限制酶EcoR切割质粒会将目的基因插入启动子上游，目的基因不能正确表达；使用限制酶Hind 切割质粒将破坏标记基因，不利于目的基因的鉴定和筛选，因此该过程中应使用限制酶BamH切割质粒，C正确；为了防止污染环境，对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行灭菌处理，D正确。题组三蛋白质工程5(2022海南海口高三模拟)利用
23、木聚糖酶进行纸浆漂白，可以大幅度减少氯化物的用量，减轻造纸工业对环境的污染。纸浆漂白需要在高温碱性条件下进行，因此需要耐热耐碱的木聚糖酶。根据生产需要，科学家对已知氨基酸序列的木聚糖酶进行改造，获得了耐高温耐碱的新木聚糖酶，减少了纸浆漂白时木聚糖酶的用量，提高了生产效率。请回答下列问题：(1)蛋白质工程的目标是根据人们对 的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。与蛋白质工程相比，基因工程原则上只能生产 。(2)在蛋白质工程和基因工程中常用大肠杆菌作为受体细胞，原因是大肠杆菌 (答出两点)。分离纯化大肠杆菌时，可使用接种环采用 法将聚集的菌种逐步分离并培养成单菌落；实验室中利用选择培养基筛选微生
24、物的原理是 。(3)人工合成的新木聚糖酶的基因在导入受体细胞前要先构建 ，以使目的基因能够表达和发挥作用。若要将重组大肠杆菌分泌的耐热耐碱木聚糖酶应用于造纸工业生产，除了需要研究木聚糖酶的产量外，还需要检测木聚糖酶的 。(4)有研究表明，在木聚糖酶中特定部位引入精氨酸可以增加木聚糖酶中的离子键数目，从而增加该酶在碱性环境中的稳定性。利用蛋白质工程技术改造木聚糖酶，其基本思路是 。根据新木聚糖酶的氨基酸序列设计新木聚糖酶的基因，会设计出多种脱氧核苷酸序列，原因是 。答案(1)蛋白质功能自然界中已存在的蛋白质(2)为单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少平板划线人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或
25、阻止其他微生物的生长(3)基因表达载体生物活性(催化效率)(4)根据需要对耐碱的木聚糖酶的功能特点，设计新木聚糖酶中特定部位引入精氨酸以后的氨基酸序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪合成新木聚糖酶基因密码子具有简并现象(或存在多种密码子决定同一种氨基酸的现象)题组四生物技术的安全性和伦理问题6(2022江苏高三模拟)根据下列2份材料回答有关生物技术的问题：材料一2012年诺贝尔医学奖获奖者分别是来自日本的科学家山中伸弥和来自英国的科学家约翰格登。约翰格登去除一只爪蟾卵细胞的细胞核，代之以取自蝌蚪的一个特殊细胞的细胞核。经处理的卵细胞发育成一只正常的蝌蚪。数十年后其他学者后
26、续进行的核移植实验成功克隆出哺乳动物，因而约翰格登被尊为“克隆教父”。2001年11月25日，美国先进细胞技术公司利用成人细胞首次克隆出人类早期胚胎，消息公布后，引起全世界的轩然大波；11月29日，中国卫生部明确表示：中国不赞成、不支持、不接受任何克隆人实验，赞成以治疗和预防疾病为目的的人类胚胎干细胞研究，但研究必须是有序的，并要在有效监控条件下进行。(1)动物的克隆方法一般是供体(被克隆个体)的体细胞的核去核卵细胞重组细胞早期胚胎个体。“多莉”的诞生采用了上述技术路线，一般认为这种生殖(繁殖)方式是_生殖。b过程在离体条件下进行，除了营养和适宜电脉冲刺激之外，至少还需要_(答出2点即可)等条
27、件；c过程中应用了 技术。(2)克隆技术的突破说明了 。(3)克隆人在全世界引起轩然大波，中国卫生部反对克隆人，原因是 。A克隆立法相对滞后B如果克隆人早期胚胎的试验不加控制地进行下去，克隆人终将诞生C克隆人一旦出现，人类的许多伦理观念都会被推翻，同时会带来人种优化、宗教混乱等社会政治问题D克隆技术并不绝对成熟，不能保证克隆出无缺陷的人E大力推广克隆技术对保持生物多样性具有重要意义材料二2006 年，山中伸弥首次利用逆转录病毒将四种转录因子“Oct4，Sox2，cMyc，Klf4”导入已分化完全的小鼠成纤维细胞中，将其重新编排变成全能性的类胚胎细胞，这些重编排的细胞被命名为“诱导多能干细胞”，即iPS细胞。(4)近些年的研究显示，iPS细胞可以产生出机体内所有种类的细胞，由iPS细胞产生其他种类细胞的过程称为 。(5)目前iPS细胞在实际应用中还存在许多问题。例如，有研究发现iPS细胞的增殖难以控制，即iPS细胞具有 细胞的特征。结合山中伸弥的研究过程分析，产生这种变化的最可能的原因是 。答案(1)无性适宜的温度、pH、渗透压，无菌无毒的环境胚胎移植(2)高度分化的动物细胞核具有全能性(3)ABCD(4)细胞分化(5)癌逆转录病毒含有病毒癌基因以及致癌有关的核酸序列，可通过感染小鼠的成纤维细胞，将其基因组整合进入小鼠的成纤维细胞中，诱发细胞癌变