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1、考点四基因工程1基因工程的理论基础2基因工程的3种基本工具3熟记基因工程的四个操作步骤(1)目的基因的筛选与获取途径(2)基因表达载体(重组质粒)的构建(3)将目的基因导入受体细胞(4)目的基因的检测与鉴定4图解记忆蛋白质工程5PCR技术原理与条件6PCR技术的过程7DNA的粗提取与鉴定8DNA片段的扩增及电泳鉴定1(2020山东，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载
2、体时，所需的酶是_，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为_。(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了_，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列_(填“发生”或“不发生”)改变，原因是_。(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是_。(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测
3、糯性最强的品系为_，原因是_。答案(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶转化(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合不发生编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子(3)逆转录(或反转录)引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)(4)品系3品系3的Wx mRNA量最少，控制合成的直链淀粉合成酶的量最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强解析(1)构建基因表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以对目的基因和载体进行切割和连接，重组载体进入受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚
4、合酶的识别和结合，从而改变基因的转录，3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)通过mRNA获得cDNA是逆转录(或反转录)过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。(4)据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中的Wx mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最
5、小，糯性最强。2(2021山东，25)人类基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1F7末端添加的序列所对应的限制酶是_，在R末端添加的序列所对应的限制酶是_。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程
6、共需要_种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是_。(3)向培养液中添加适量的雌性激素，含F1F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于_，理由是_。答案(1)SalEcoR6(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达(3)引物F4与F5在调控序列上所
7、对应序列之间的区段上根据有无荧光情况判断，F1F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上解析(1)据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶
8、识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun和Xho的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun和Xho所识别，故应该选用添加限制酶EcoR和限制酶Sal识别序列，由图可知，限制酶Mun识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR，在F1F7末端添加的序列所对应的限制酶是Sal；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun和Xho切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun和Xho切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR和限制酶Sal识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下
9、，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq DNA聚合酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq DNA聚合酶、限制酶EcoR、限制酶Sal、限制酶Mun、限制酶Xho、DNA连接酶。(2)受体细胞中已经除去BCL11A基因，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌性激素，此时重组载体上的BCL11A基
10、因表达，产生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白的结合位点在引物F4与引物R之间的序列上；含F5F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。思维延伸填充(1)(2019全国，38节选)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是加热至90_以上。在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DN
11、A聚合酶的主要原因是Taq_DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。(2)(2018江苏，32节选)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。(3)(2016全国，40节选)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到氨苄青霉素抗性基因(Ampr)或四环素抗性基因(Tetr)中会导致相应的基因失活。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用BamH酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。如果用含有氨苄青霉素的
12、培养基进行筛选，在上述处理后大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长；并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞也是不能区分的，其原因是二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基。(4)(2017全国，38节选)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子(答出两点即可)。(5)(2017全国，38
13、节选)若获得的转基因植株(目的基因几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。(6)(2019天津9节选)B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。据图回答：在过程、转化筛选时，过程中TDNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程在培养基中应加入卡那霉素。(7)(2019江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时
14、应选择的一对引物是乙、丙。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是目的基因反向连接。(8)(2019海南，31节选)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。题组一基因工程1(2021山东济南市高三二模)COVID19的抗原性及感染性与其表面的S蛋白(刺突糖蛋白)密切相关，现利用基因工程的方法生产相关
15、疫苗。图甲为构建S蛋白基因表达载体的过程，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果。请回答下列问题：(1)过程所使用的酶为_，为保证PCR技术扩增S蛋白基因正常进行，该反应体系的主要成分有_。PCR技术中低温复性的目的是_。(2)PCR过程经过4次循环，需要的引物的数量是_个。(3)构建好的重组质粒长度共2 000 bp，用限制酶Hind及限制酶Hind和BamH分别对重组质粒进行切割并电泳，结果如图乙所示，可推测BamH在重组质粒上有_个酶切位点。为使S蛋白基因在受体细胞中高效表达，需要把S蛋白基因正确插入重组质粒的_之间。(4)目前人们注射的新冠疫苗中有一种为腺病毒载体疫苗。该疫苗是将S蛋白基
16、因插入到改造之后的腺病毒基因组中，待腺病毒侵染人体后，可引发机体的免疫反应。请用文字和箭头写出腺病毒载体疫苗进入机体后产生抗体的过程：_。答案(1)逆转录酶模板DNA、4种脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶引物结合到互补DNA链(2)30(3)3启动子和终止子(4)S蛋白基因mRNAS蛋白作为抗原体液免疫抗体解析(1)过程是利用RNA合成DNA的过程，是逆转录，需要逆转录酶，PCR过程中，其反应体系的主要成分有模板DNA、4种脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶；低温复性的目的是让引物结合到互补DNA链。(2)PCR技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n12，因
17、此若一个该DNA分子在PCR仪中经过4次循环，需要241230(个)引物。(3)用Hind将长度为2 000 bp的质粒切割后形成了200 bp、400 bp和1 400 bp共3个片段，而用Hind和BamH将质粒切割后形成了200 bp、420 bp、560 bp的片段，2 00042025602003，因此BamH在重组质粒上有3个酶切位点。(4)腺病毒载体疫苗是S蛋白基因插入到改造之后的腺病毒基因组中，其表达的产物是S蛋白，作为抗原刺激机体启动体液免疫产生抗体，其过程见答案。2(2021济南市山东省实验中学高三二模)新冠病毒给人们的日常生产、生活带来很大的影响，因此研发新冠病毒疫苗受到
18、广泛关注。疫苗研制时常需要构建重组病毒载体，部分过程如下图所示，其中AC表示结构或物质，Nco、Sph、Nhe、BamH四种酶的识别序列和酶切位点详见下表。限制酶NcoSphNheBamH识别序列和切割位点CCATGGGCATGCGCTAGCGGATCC(1)分析图中C的黏性末端可确定，需要用_(填限制酶名称)切割质粒B。(2)重组质粒1用_(填限制酶名称)处理获得线性化片段，在缓冲液中将其与某克隆片段混合，适宜条件下成功连接。由图可知线性分子可以与克隆片段连接成环的原因可能是_。(3)获得的重组病毒载体可以导入工程菌，高效表达出_用于制备疫苗。与减毒活疫苗比较，该类疫苗安全性更高，其原因是_
19、。(4)新冠病毒感染人体后，其S蛋白识别人体细胞膜蛋白ACE2并与之结合，使病毒侵入细胞，同时会引起人体相应的免疫反应。重组人源蛋白ACE2可用于治疗新冠病毒肺炎，请推测该药物的作用机理：_。答案(1)Nco和BamH(2)Nco具有相同的黏性末端(3)S蛋白此疫苗不含新冠病毒的核酸，不会在人体内繁殖(4)重组人源中的ACE2蛋白(与细胞膜蛋白ACE2)竞争性的与S蛋白结合，降低新冠病毒对细胞的黏附和感染解析(1)通过该病毒逆转录的DNA黏性末端序列，能识别剪切该序列的限制酶分别是Nco和BamH，因此用该两种酶切割质粒。(3)病毒表面的S蛋白刺激机体产生特异性免疫，因此获得的重组病毒载体导入
20、工程菌后表达出S蛋白作为疫苗；该疫苗没有新冠病毒的核酸，不会在机体内增殖，因此更安全。(4)新冠病毒糖蛋白S识别人体细胞膜蛋白ACE2并与之结合，若给患者注射大量可溶性ACE2蛋白，新冠病毒结合注入的ACE2蛋白从而对细胞的黏附和感染能力减弱达到治疗的目的。题组二蛋白质工程3(2021青岛高三模拟)基因工程抗体又称重组抗体，是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。下图为某研究所制备小鼠抗甲肝病毒抗体的流程图。回答下列问题：(1)实验室构建重组质粒时，为保证目的基因与载体的正确连接，过程最好选择的限制酶是_。(2)
21、在重组质粒中，目的基因首端的启动子能够_，从而驱动目的基因的转录。除启动子之外，重组质粒还应该包含_。(3)为了筛选出导入目的基因的骨髓瘤细胞，可以在过程的培养液中添加_，过程所获得的细胞具有_的特点。(4)临床试验发现，过程提取的小鼠抗甲肝病毒抗体具有外源性，容易被人体的免疫系统清除，从而导致其治疗效果大大降低。如图抗体中的A区是与抗原特异性结合的区域，B区是引起人体免疫反应的区域。若要避免小鼠抗甲肝病毒抗体被人体免疫系统清除，请提出合理的改造思路。_。答案(1)EcoR和BamH(2)与RNA聚合酶结合终止子、目的基因、标记基因(复制原点)等(3)(适量的)青霉素既能大量增殖，又能产生足够
22、数量的特定抗体(抗甲肝病毒抗体)(4)采用蛋白质工程技术将小鼠抗甲肝病毒抗体上B区域进行改造，或替换成人体相应抗体的B区，进而降低人体对该抗体的免疫排斥解析(1)图中EcoR会破坏目的基因，故不能用于切割目的基因，目的基因和载体共同含有的限制酶还有EcoR和BamH，为了保证目的基因与载体的正确连接，应该选择EcoR和BamH切割目的基因和载体。(3)重组质粒中含有青霉素抗性基因，故可以在过程的培养液中添加青霉素，来筛选导入目的基因的骨髓瘤细胞。过程所获得的细胞是含有目的基因的骨髓瘤细胞，既能大量增殖，又能产生足够数量的抗甲肝病毒抗体。4(2021山东潍坊高三模拟)人体内的tPA蛋白能高效降解
23、血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但大剂量使用会诱发颅内出血。如果将tPA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。先对天然的tPA基因进行序列改造，然后在大肠杆菌中表达改造后的基因，可得到性能优异的改良tPA蛋白。下图是通过重叠延伸PCR技术获取tPA改良基因和利用质粒pCLY构建含tPA改良基因的重组质粒示意图(图中重叠延伸PCR过程中，引物a、b用来扩增含有突变位点的上游DNA序列，引物c、d用来扩增含突变位点的下游DNA序列)。请回答：(1)生产改良tPA蛋白的技术属于_工程。(2)已知tPA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链(图中tPA基因的上链)上的碱基序列是ACA
24、，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点表示突变部位的碱基，引物b中该部位的碱基是_，引物c该部位的碱基是_。PCR中需要引物的原因是_。(3)重叠延伸PCR中，PCR1和PCR2分别进行，产物混合后再进行PCR3。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是_。(4)构建重组质粒时，选用的限制酶是_。重组质粒中的新霉素抗性基因的作用是_。(5)在加入新霉素的培养基中能正常生长的大肠杆菌并非都是目的菌株，仍需选择呈_色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良tPA蛋白的工程菌。答案(1)蛋白质(2)GCDNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链(3)引物b和
25、引物c可以互补配对，导致引物失效(4)Xma和Bgl筛选出导入质粒pCLY(普通质粒)和重组质粒的大肠杆菌(受体细胞)(5)白解析(1)由题干信息可知，上述生产改良tPA蛋白的技术是先对天然的tPA基因进行序列改造，然后在大肠杆菌中表达改造后的基因，可得到性能优异的改良tPA蛋白，因此属于蛋白质工程。(2)已知tPA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链(图中tPA基因的上链)上的碱基序列是ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将tPA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则tPA基因上链第84位发生碱基替换为ACAAGA，图中显示引物b与tPA基因的下链互
26、补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G，引物c与tPA基因的上链互补，故其中相应部位的碱基与下链相同，即该部位的碱基是C，由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，因此PCR中需要加入合适的引物来完成子链的延伸。(3)图中信息显示，引物b和引物c可以互补配对，会导致引物失效，因此，如果PCR1和PCR2同时进行，无法达到预期目的。(4)根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶Xma和Bgl切割质粒，才能与目的基因tPA改良基因高效连接。在构建重组质粒时，其中的新霉素抗性基因没有被破坏，因此可以根据对新霉素的抗性将成功导入质粒的大肠杆菌筛选出来，即新霉素抗性基因为标记基因，作用是便于筛选出成功导入质粒(普通质粒和重组质粒)的大肠杆菌。(5)在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞应该包含两种类型：一类是导入普通质粒的大肠杆菌，这类大肠杆菌细胞因为含有LacZ基因而呈蓝色；另一类是导入重组质粒的大肠杆菌，因为其中的LacZ基因在构建重组质粒时被破坏，则该细菌表现为白色。因此需选择呈白色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良tPA蛋白的工程菌。