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1、题型一PCR技术的相关计算1.PCR扩增过程中的循环图示与规律2.PCR中的数量关系循环次数123nDNA分子数2482n含引物A(或B)的DNA分子数1372n1同时含引物A、B的DNA分子数0212222262322n2共消耗的引物数量22112622121423122n123.PCR技术的应用新冠病毒核酸检测(1)RTPCRRTPCR是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术。首先经逆转录酶的作用，由RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增合成目的片段。提醒因为新冠病毒中的核酸为RNA，而RNA极易降解，为了防止RNA在检测过程中
2、降解，我们把它转换为更稳定的DNA。(2)实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。TaqMan探针法是其中一种检测方法。探针完整时，荧光报告基团(R基团)发射的荧光信号被荧光淬灭基团(Q基团)吸收；PCR扩增时，耐高温的DNA聚合酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。(3)实时荧光定量PCR方法检测新冠病毒核酸从样本中
3、提取病毒RNA，经逆转录酶作用形成cDNA。然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。在通过实时荧光定量PCR检测新冠病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图所示。与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，可能原因有底物浓度下降、酶活性下降等。Ct值的含义是指在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。当样本中初始模板越多时，Ct值就越小。Ct37判定为阳性，Ct40或无Ct值判定为阴性。上图所示新冠病毒核酸检测结果应判定为阳性。例1 (2023山东烟台期中)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是：在
4、PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某模板链互补的荧光探针，荧光探针两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，荧光监测系统接收不到荧光信号。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号。即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图所示)。相关叙述正确的是()A.扩增过程中引物先于探针结合到模板DNA上B.在PCR系统中需加入解旋酶C.荧光信号积累越多，说明PCR循环次数越多D.若扩增n次，则其需要消耗2n1个探针答案C解析基因扩增过程中需要特定的引物，该引物的作用是定位基因的位置，与模板链结合并为
5、子链的延伸提供起点，扩增过程中引物和探针应同时结合到模板DNA上，A错误；在PCR反应系统中无需加入解旋酶，可通过高温解旋DNA，B错误；据题干信息“即每扩增一次，就有一个荧光分子生成”可知，荧光信号积累越多，说明PCR循环次数越多，C正确；据题干信息“在PCR反应体系中每加入一对引物的同时加入一个与某模板链互补的荧光探针”，即每个DNA分子需要1个探针，扩增n次，可得到2n个DNA分子，则共需要消耗2n1个探针，D错误。例2 (2023湖南雅礼中学调研)新冠病毒是一种单链RNA病毒，常用“荧光RTPCR技术”进行检测，方法是取受检者的mRNA逆转录出cDNA，并大量扩增，用荧光标记的新冠病毒
6、核酸探针来检测样品中新冠病毒的核酸含量。请回答下列问题：(1)“荧光RTPCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有_、_、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。(2)如果要同时扩增两种基因，则试剂盒中的引物应该有_种。图1为新冠病毒的“ORFlab”基因对应的cDNA片段结构示意图，则与之对应的引物结合的部位应该是图中的_(子链延伸方向为其自身的53，用图中数字作答)。若已知该基因的一条引物，_(填“能”或“不能”)依据其碱基序列设计出另一条引物，理由是_。图1(3)在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断积累，荧光信号的强度也随之增加。根据荧光强度的变化监测产物量的变化，得到一条荧
7、光扩增曲线(如图2)。图2出现“平台期”最可能的原因是_。理论上，在检测过程中，有荧光信号出现，则说明检测结果呈_(填“阴”或“阳”)性，但为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。现有两个待检样本，检测时都出现了如图2所示的曲线，但甲的A点比乙的A点明显左移。请给这种结果作出科学合理的解释(试剂盒合格且正常，操作过程规范且准确)：_。答案(1)逆转录酶耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)(两空顺序可颠倒)(2)44、1不能两种引物的碱基序列没有相关性(3)试剂盒中的原料、引物和探针数量一定，超出一定的循环数后，荧光分子不再增加阳甲样本中的新冠病毒核酸含量更高，达到阈值所需
8、的循环数更少解析(1)根据题目信息可知，荧光RTPCR技术基本原理是将新冠病毒RNA逆转录为cDNA，因此荧光RTPCR技术所用的试剂盒中通常都应该含有逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸、缓冲体系。(2)根据PCR的原理，在扩增DNA分子时每一条链均需与相应的引物结合才能进行扩增，因此如果要将两种基因分别扩增出来，则在试剂盒中的引物应该有4种；在利用PCR扩增DNA分子过程中，DNA聚合酶只能从引物的3端开始连接脱氧核苷酸，又由于DNA的两条链是反向平行的，所以引物与DNA分子单链的3端(OH)相结合即图示中的1和4所示部位。由于两段引物的碱基序列没有相关性，既不相同，也不互
9、补，因此不能根据该基因一条引物的碱基序列设计出另一条引物。(3)分析荧光扩增曲线图，图中曲线通过荧光强度变化反映产物量的变化，因此曲线中出现“平台期”最可能的原因是试剂盒中的原料和探针数量一定，超出一定的循环数后，荧光强度不再增加。理论上，在检测过程中，有荧光信号出现，则说明检测结果呈阳性，但为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。检测结果甲的A点比乙的A点明显左移，说明甲样本中的新冠病毒核酸含量更高，达到阈值所需的循环数更少。题型二DNA片段电泳与遗传试题的综合DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团带有正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电
10、荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。不同大小的DNA片段迁移速率不同，凝胶中的DNA分子通过染色可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。因此琼脂糖凝胶电泳能够用于分离、鉴定和纯化DNA片段。等位基因由基因突变而来，若一对等位基因A、a经过限制酶切割后形成的DNA片段分子量不同，则在电场作用下移动距离不同，最终使得A、a得以分开，形成不同的条带。例3 (2023西安高新一中质检)图1是某遗传病家系的系谱图，对该家系中14号个体进行基因检测，将含有该遗传病基因或正常基因的相关DNA片段用电泳法分离。正常基因显示一个条带，患病基因显示为另一个不同的条带，结果如图2所示。下列有关分析判断错误的是(
11、)图1图2A.图2中的编号c对应系谱图中的4号个体B.条带2的DNA片段含有该遗传病致病基因C.8号个体的基因型与3号个体的基因型相同的概率为D.9号个体与该遗传病致病基因携带者结婚，孩子患病的概率为答案D解析分析系谱图：1号和2号都正常，但他们的女儿患病，说明该病为常染色体隐性遗传病。图中4号为患者，属于隐性纯合子，对应图2中的c，A正确；分析可知，1、2号都是杂合子，4号为隐性纯合子，而图2中a、b和d为杂合子，c为纯合子，则3号也为杂合子，c为隐性纯合子，则条带2的DNA片段含有该遗传病致病基因，B正确；假设相关基因用A、a表示，根据图2可知，3号的基因型为Aa，根据图1可知，8号的基因
12、型及概率为AA或Aa，因此两者相同的概率为，C正确；9号的基因型及概率为AA或Aa，他与该病携带者(Aa)结婚，孩子患病的概率为，D错误。例4 (2023广东珠海调研)一对等位基因(用D、d表示)，在某种限制酶的作用下可以切割形成两种不同长度的DNA片段。对酶切后获得的DNA片段用凝胶电泳法进行分离，然后与特定的DNA探针杂交后可显示出不同的带谱。根据显示出的带谱组型可以判断基因型组成。现有一对夫妇及其所生四个儿女的相关基因定位鉴定获得的带谱如图，且1号性状与家庭的其他成员不同。关于这四个儿女的基因型推断正确的是()A.3号为Dd，4号为DDB.1号为XdXd，2号为XDYC.1号为DD，2号为ddD.3号为XDXd，4号为XdYd答案A解析分析题图可知，夫妻双方的带谱相同，因此不可能是伴X遗传，B、D错误；又因为代的夫妇的基因定位鉴定获得的带谱是两条，均为杂合子，则此夫妇基因型均为Dd，因此后代的基因型可能为DD、Dd、dd三种。分析子代的基因定位鉴定获得的带谱可知，1具有一条带谱，且1号性状与家庭的其他成员不同，说明1为隐性纯合子dd，2号只有一条带谱，且与1号性状不同，为DD，C错误；3号含有两条带谱，为Dd，4号与2号相同，为DD，A正确。