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1、(五)生物技术与工程1(2022江苏连云港高三模拟)泡菜传统自然发酵方式的发酵周期相对较长，生产效率低。研究人员欲从泡菜中分离筛选出高产酸乳酸菌，为泡菜工厂化生产提供依据。请分析并回答下列问题：(1)配制CaCO3MRS培养基。成分：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、磷酸氢二钾、葡萄糖、琼脂粉、碳酸钙等。根据物理性质分类，该培养基属于_培养基，为乳酸菌种提供氮源的成分是_；培养过程中，乳酸菌产生乳酸溶解碳酸钙，形成溶钙圈，便于_。(2)高产酸乳酸菌的培养与分离。其部分实验目的与具体操作如下所示，请完成下表。实验目的简要操作过程梯度稀释在无菌条件下取样品中泡菜汁1 mL，加入_进行10倍梯度稀释，依次得到
2、105、106、107的稀释液接种培养取上述稀释液1 mL分别加入无菌培养皿中，然后将CaCO3MRS培养基浇注混匀冷凝后，将培养皿_，并连续培养48 h分离纯化挑取_进行平板划线培养长期保存将菌种加入30%的甘油中在20 保存(3)高产酸乳酸菌的鉴定。提取筛选乳酸菌的DNA，通常采用16SrDNA(编码 rRNA对应的DNA序列)的通用引物进行PCR扩增并测序鉴定。以16SrDNA作为细菌分类依据的原因是不同菌属的16SrDNA具有_。(4)高产酸乳酸菌发酵效果检测。研究人员研究了两种高产酸乳酸菌(乳酸菌A50f7和A50b9)在发酵泡菜过程中pH的变化，结果如图所示。据图分析，该研究实验的
3、自变量是_，可以看出，接种两种乳酸菌效果相近，其相近之处表现为_。答案(1)固体蛋白胨、牛肉膏、酵母粉筛选高产酸乳酸菌(2)9 mL无菌水倒置有明显溶钙圈的菌落(3)差(特)异性(4)乳酸菌的种类和接种量(发酵时间)均能快速降低泡菜发酵过程中的pH，且接种量越大作用效果越明显解析(1)琼脂是凝固剂，根据物理性质分类，该培养基属于固体培养基；氮源是指提供氮元素的物质，蛋白胨、牛肉膏、酵母粉含有氮元素，可为乳酸菌种提供氮源；培养基中含有碳酸钙，乳酸菌产生乳酸会与碳酸钙反应形成溶钙圈，便于筛选高产酸乳酸菌。(2)要分离和培养高产酸乳酸菌，首先对泡菜汁进行梯度稀释，稀释时需要用无菌水，如1 mL泡菜汁
4、9 mL无菌水，相当于对泡菜汁稀释了10倍，以此类推；培养时为了防止冷凝水滴落冲散菌落，应将培养皿倒置培养；溶钙圈明显的菌落，产乳酸菌的能力强，应挑取有明显溶钙圈的菌落进行平板划线培养。(3)不同菌属的16SrDNA具有差(特)异性，PCR能鉴定不同的DNA，因此能采用16SrDNA(编码 rRNA对应的DNA序列)的通用引物进行PCR扩增并测序鉴定不同菌属。(4)自变量是人为改变的量，据图分析，该研究实验的自变量是乳酸菌的种类(乳酸菌A50f7和A50b9)和接种量(发酵时间)；结合图示结果可知，两种乳酸菌均能快速降低泡菜发酵过程中的pH，且接种量越大作用效果越明显，效果相近。2(2022江
5、苏南京高三检测)基因工程自20世纪70年代兴起后，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面，展示出广阔的前景。如图是通过基因工程获得转基因生物或产品的流程图，请结合相关知识回答下列问题：(1)转基因生物反应器是指利用基因工程技术手段将外源基因转化到受体中进行高效表达，从而获得具有重要应用价值的表达产物的生命系统，包括转基因动物、转基因植物和转基因微生物。若利用图示流程构建小鼠乳腺生物反应器批量生产人抗利尿激素，应先从人体_细胞中获取总RNA，通过反转录获得cDNA，再PCR后获得抗利尿激素基因。一条单链cDNA在PCR仪中进行n次循环，需要消耗_个引物。构建的表达载体导入的受体细胞是_。膀胱反应器有
6、着和乳腺反应器一样的优点：收集产物蛋白比较容易，不会对动物造成伤害。此外膀胱生物反应器还具有的显著优势在于不受转基因动物的_(答2点即可)的限制，而且从尿中提取蛋白质比在乳汁中提取简便、高效。若图中的受体细胞是大肠杆菌，通常用Ca2处理大肠杆菌，其目的是使大肠杆菌处于_的生理状态。理论上制备能分泌抗利尿激素的“工程菌株”时，酵母菌比大肠杆菌更适合作为受体细胞，从细胞结构与功能的角度分析，原因是：_。(2)全球新冠疫情形势依然非常严峻，新冠病毒疫苗的研制和新冠病毒的快速检测的研究具有重要作用。目前新冠疫苗有灭活疫苗、基因疫苗、蛋白疫苗等。利用图示流程制备新冠病毒S蛋白疫苗。图中质粒A上m、n分别
7、是启动子和终止子，箭头处是限制酶的切点(Nco ：5CCATGG3；Nhe ：5GGATCC3)，根据S蛋白的RNA制备的目的基因S无法与载体A连接，需要在S基因两侧加接末端，若b链处加接末端5GATC，则在a链处加接末端5_。由图推测，目的基因S转录的模板链是_(填“a链”或“b链”)。抗原检测采用双抗体夹心法，其原理如图。结合垫处含有足量的、可移动的、与胶体金结合的抗体1，T处固定有抗体2，抗体1和抗体2与新冠病毒表面同一抗原N蛋白的不同位点发生特异性结合，呈红色。C处固定有抗体1的抗体，与抗体1结合也呈红色。检测过程中反复进行了抗原抗体的特异性结合，若检测结果为阳性，则过程中此特异性结合
8、共发生_次。若待测样本中不含新冠病毒，显色结果为_，结果为阴性。利用单克隆抗体制备技术制备试剂盒中的抗体1。先给小鼠注射纯化的N抗原蛋白，一段时间后，从小鼠的_(免疫器官)中获取已免疫的B淋巴细胞，将获得的细胞与骨髓瘤细胞融合，再经过选择培养基筛选、_，获得产生特定抗体的杂交瘤细胞，再经体外培养或注射到小鼠腹腔内培养，最终获得抗N抗原蛋白的单克隆抗体。答案(1)下丘脑2n1受精卵性别、年龄能吸收周围环境中DNA分子酵母菌是真核生物，具有内质网、高尔基体，可对蛋白质进行加工并分泌到细胞外，便于提取(2)CATGb链3只有C处出现红色脾脏克隆化培养和抗体检测解析(1)要批量生产人抗利尿激素，人的抗
9、利尿激素基因在下丘脑中表达，所以需要从下丘脑细胞中获取总RNA，经过逆转录形成cDNA；一条单链cDNA在PCR仪中进行n次循环，共产生2n1个DNA分子，所以共有2n条链，其中2n1条链是新合成的，需要引物，所以需要2n1个引物。实验目的是要获得小鼠乳腺生物反应器，所以需要将基因表达载体导入动物细胞的受精卵中；与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产抗利尿激素，可从动物一出生就收集产物，不受动物性别和年龄的限制。用Ca2处理大肠杆菌，其目的是使大肠杆菌处于感受态，有利于吸收周围环境中DNA分子；大肠杆菌是原核生物，没有细胞器，而酵母菌是真核生物，具有内质网、高尔基体，可对蛋白质进行加工并分
10、泌到细胞外，便于提取，所以制备能分泌抗利尿激素的“工程菌株”时，酵母菌比大肠杆菌更适合作为受体细胞。(2)根据题干信息，质粒用了Nco和Nhe进行切割，分别产生了5CATG3和5GATC3的黏性末端，所以需要在S基因b链处加接末端5GATC和a链处加接末端5CATG的黏性末端，使其能够互补配对；b链处加接末端5GATC，所以和质粒的Nhe切割处相连，a链和质粒上限制酶酶切位点Nco相连，转录方向为mn，且转录只能从模板链的3端开始，因此b链是模板链。若检测结果为阳性，则这种结合有3次，第一次是与结合垫上的抗体1结合，第二次与T处固定的抗体2结合，第三次是与C处垫上固定有抗体1的抗体结合。若待测
11、样本中不含新冠病毒，则不会与结合垫上的抗体1结合，也不会和T处抗体2结合，但由于抗体1是可移动的，所以游离的抗体1移动至C处，C处固定有抗体1的抗体，与抗体1结合也呈红色，因此C处将变红，所以如果只有C处出现红色，则结果为阴性。在制备抗体1的过程中，将从免疫(注射一种纯化的抗原蛋白)小鼠的脾脏中获取的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，再经过选择培养基筛选、克隆化培养和抗体检测，获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。3(2022江苏南京高三模拟预测).有文章称单位面积手机表面的细菌比马桶按钮上的多。某校甲、乙两研究性学习小组通过如图所示实验展示调查结果。(1)实验使用的培养基，含有营养物质和_。制备培养基时，
12、应将pH调至_。图中继续实验中可能包含的实验操作依次有_、_、_。(2)通过观察菌落的特征可知，手机屏幕和马桶按钮上都存在多种微生物。两研究性学习小组实验操作均正确且完全一致，但结果截然不同。可能的原因是_。(3)实验中，两研究性学习小组釆用的接种方法是_。图示操作取样固定实验员欲测定某手机屏幕的细菌数量，将10 mL细菌悬液进行梯度稀释，分别取0.14 mL稀释倍数为102的样品液接种到三个培养基上培养一段时间后，统计菌落数分别为38、40、42，则该手机屏幕的细菌数为_个/cm2。.研究人员将某细菌的抗虫基因C转入棉花细胞内，成功获得了抗虫转基因棉花，在一定程度上减少了杀虫剂的使用，减少了
13、环境污染，提高了作物的产量和质量。(4)提取某细菌总RNA，经逆转录形成互补的DNA(cDNA)，再利用PCR技术选择性扩增C基因的cDNA，PCR过程中DNA先后经历高温变性复性延伸过程，故反应体系中需加入_酶。(5)常用农杆菌与经_处理后的外植体共培养一段时间完成转化，需先将C基因的cDNA插入到Ti质粒的TDNA上并导入农杆菌，有利于_。若要检测目的基因是否反向插入，_(填“能”或“不能”)根据带标记的目的基因单链作探针的核酸分子杂交结果判断。.基因编辑技术(CRISPR/Cas9技术)是一种对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，其原理是由一个向导RNA(sgRNA)分子引导Cas9蛋白到
14、一个特定的基因位点进行切割(如图)。请据图回答：(6)CCR5基因是人体的正常基因，其编码的细胞膜通道蛋白CCR5是HIV入侵辅助性T淋巴细胞的主要辅助受体之一。科研人员依据_的部分序列设计sgRNA序列，导入骨髓造血干细胞中，构建sgRNACas9复合体，以实现对CCR5基因的定向切割，变异的CCR5蛋白无法装配到细胞膜上，即可有效阻止HIV侵染新分化生成的_从而有效减缓病症。答案(1)凝固剂(琼脂)中性或微碱性稀释涂布接种(2)取样部位不同(3)稀释涂布平板法1.14104(4)逆转录酶和耐高温的DNA聚合(5)消毒目的基因进入受体细胞并整合到染色体DNA上不能(6)CCR5基因辅助性T细
15、胞解析(1)培养基中的营养物质主要有碳源、氮源、生长因子、水分、无机盐等，此外还需加入凝固剂如琼脂等；培养细菌时需将pH调至中性或微碱性；图中继续实验的步骤包括稀释、涂布、接种等。(2)两小组的实验操作均正确且完全一致，但结果截然不同，可能是因为手机的取样和马桶的取样部位不同。(3)据图可知，培养基中的菌落均匀分布，所用接种方法是稀释涂布平板法；稀释涂布平板法统计菌落数目时应统计菌落数在30300之间的，故手机屏幕的细菌数为(384042)30.1410210(55) 1.14104(个/cm2)。(4)提取某细菌总RNA，经逆转录形成互补的DNA，该过程需要逆转录酶；PCR过程中需要达到90
16、 以上的高温，需要耐高温的DNA聚合酶。(5)植物组织培养的关键是无菌操作，故常用农杆菌与经消毒后的外植体共培养一段时间完成转化；需先将C基因的cDNA插入到Ti质粒的TDNA上并导入农杆菌，有利于目的基因进入受体细胞并整合到染色体DNA上；目的基因只要插入，即可与探针产生杂交带，故若要检测目的基因是否反向插入，不能根据带标记的目的基因单链作探针的核酸分子杂交结果判断。(6)CCR5基因是人体的正常基因，其编码的细胞膜通道蛋白CCR5是HIV入侵辅助性T细胞的主要辅助受体之一，由于T细胞是由造血干细胞分化形成的，因此，可依据CCR5基因的部分序列设计sgRNA序列，导入骨髓造血干细胞中，构建s
17、gRNACas9复合体，以实现对CCR5基因的定向切割，变异的CCR5蛋白无法装配到细胞膜上，即可有效阻止HIV侵染新分化生成的辅助性T细胞。4(2022江苏无锡高三模拟)目的基因在酵母菌细胞中表达出的蛋白可能被细胞内的蛋白酶降解，某科研团队构建重组表达载体解决了此问题。如图为该重组表达载体构建示意图，图中改造了的目的基因序列融合了信号肽的核酸序列S和2个合成的核酸序列Z，信号肽能引导融合蛋白出胞，折叠后的Z肽段能与抗体IgG结合。请据图回答下列有关问题：(1)Ori是基因组的复制起始序列，是_酶的作用位点，该序列富含_碱基对。(2)Plac是启动子序列，是_酶的作用位点，转录沿DNA模板链的
18、_方向进行。(3)双酶切是构建表达载体的重要环节，下列关于双酶切的叙述，正确的是_。A目的基因内不能含有所选的酶切位点B2个酶切位点距离越近酶切效果越佳C若2种限制酶最适温度相差较大，应实行2次单酶切D确保酶切位点一个产生黏性末端另一个产生平末端，方可避免载体自连(4)为使目的基因能定向插入载体，需对目的基因进行改造，通常的做法是_。检验表达载体是否已经准确连接了目的基因，需对扩增的表达载体再次双酶切处理，完全酶切后经电泳处理，理想的结果有_条条带。目的基因进入受体细胞后，可能存在的复制形式有_。(5)菌种选育成功后，在生产实践中可用含有_的琼脂糖层析柱纯化融合蛋白。答案(1)解旋AT(2)R
19、NA聚合3端5端(3)AC(4)设计P1、P2引物时在其5端接上适宜的酶切位点(序列)2随载体进行复制；(整合到染色体DNA上，)随染色体一起复制(5)IgG解析(1)DNA的复制需要解旋酶破坏氢键，复制起始序列和解旋酶结合，开始复制；该序列富含AT碱基对，氢键较少，双螺旋容易打开。(2)启动子是启动转录的地方，与RNA聚合酶结合，启动转录；RNA聚合酶只能识别DNA模板链的3端，因此转录沿着DNA模板链的3端5端方向进行。(3)目的基因内不能含有所选的酶切位点，否则容易因酶切而被破坏，A正确；2个酶切位点距离越近，酶切越容易混乱，越难以得到两个不同的黏性末端，B错误；若2种限制酶最适温度相差较大，应实行2次单酶切，否则同时用其中的一种酶容易失活，C正确；使用两种不同的酶，使其产生两个不同的黏性末端，也能避免载体自连，不需要确保酶切位点一个产生黏性末端另一个产生平末端，D错误。(4)为使目的基因能定向插入载体，目的基因的两端也应该有相应的酶切位点，因此在PCR时，在引物里(5端)应包含酶切位点；若表达载体已经准确连接了目的基因，则应含有原来两个酶切位点，因此再用相应的双酶切，能得到两个片段；目的基因进入受体细胞后，可以随载体进行复制，也可以整合到染色体上进行复制。(5)折叠后的Z肽段能与抗体IgG结合，因此在生产实践中可用含有IgG的琼脂糖层析柱纯化融合蛋白。