《【课件】重组DNA技术的基本工具(含DNA粗提取)课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【课件】重组DNA技术的基本工具(含DNA粗提取)课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3.pptx（40页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、19441944年年艾艾弗里等人弗里等人证明了证明了DNADNA可以在同可以在同种生物的种生物的不同个体不同个体之间转移之间转移。19195050年年埃特埃特曼发明了一曼发明了一种测定氨基种测定氨基酸序列的方酸序列的方法。法。19195858年年梅梅塞尔森和塞尔森和斯塔尔用斯塔尔用实验证明实验证明了了DNADNA的半的半保留复制保留复制。19195353年年沃沃森和克里森和克里克克建立了建立了DNADNA双螺旋双螺旋结构模型结构模型。19611961年年尼尼伦伯格和伦伯格和马太马太破译破译了第一个了第一个编码氨基编码氨基酸的密码酸的密码子。子。19671967年年，科学家发科学家发现，现，在细
2、在细菌拟核菌拟核DNADNA之外的之外的质质粒粒有自我有自我复制能力，复制能力，并并可以在可以在细菌细胞细菌细胞间转移间转移。19701970年年科科学家在细学家在细菌中发现菌中发现了了第一个第一个限制性限制性内内切切核酸酶核酸酶（简称限（简称限制酶）制酶）。2020世纪世纪7070年代初年代初，多种限制多种限制酶、酶、DNADNA连连接酶和逆接酶和逆转录酶转录酶被被相继发现。相继发现。19721972年年，伯格成功伯格成功构建了第构建了第一个体外一个体外重组重组DNADNA分分子子。19731973年年，证明，证明质粒可以作为质粒可以作为基因工程的载基因工程的载体体，构建重组，构建重组DNA
3、DNA，导入受体，导入受体细胞，使外源细胞，使外源基因在原核细基因在原核细胞中成功表达，胞中成功表达，基因工程正式基因工程正式问世。问世。19197777年年，桑格桑格等科学家发明等科学家发明了了DNADNA序列分序列分析的方法析的方法。此。此后，后，DNADNA合成合成仪的问世为仪的问世为体体外合成外合成DNADNA提提供了方便供了方便。19821982年年，第一个第一个基因工基因工程药物程药物-重组人重组人胰岛素胰岛素被批准被批准上市。上市。19198383年年，科科学家采用学家采用农农杆菌转化法杆菌转化法培育出世界培育出世界上上第一例转第一例转基因烟草基因烟草。19198484年年，我国
4、科学我国科学家朱作言家朱作言领导的团领导的团队培育出队培育出世界上世界上第第一条转基一条转基因鱼因鱼。19198585年年，穆里斯等穆里斯等人发明了人发明了PCRPCR。19199090年年，人类基因人类基因组计划组计划启启动。动。20032003年完成年完成2121世纪以来世纪以来，科科学家发明了多种学家发明了多种高通量测序技术，高通量测序技术，加速了人们对基加速了人们对基因组序列的了解因组序列的了解。20132013年年，华人科华人科学家张锋及其团学家张锋及其团队首次报道利用队首次报道利用最新的最新的基因组编基因组编辑技术辑技术编辑了哺编辑了哺乳动物基因组乳动物基因组。该技术该技术可以实现
5、可以实现对特定基因的定对特定基因的定点插入、敲除或点插入、敲除或替换替换。科技探索之路基因基因工程的诞生和发展工程的诞生和发展是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。基因重组基因重组操作水平：操作结果：操作原理：DNADNA分子水平分子水平定向的改造生物遗传性状，获得人们所需的生物类型定向的改造生物遗传性状，获得人们所需的生物类型和生物产品和生物产品基因工程人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质-胰岛素的理论基础
6、是？（1）大肠杆菌和人的遗传物质都是 。（2）不同生物的DNA分子能够拼接在一起，原因是 。（3）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为 。（4）遗传信息的传递都遵循 。DNADNA中心法则中心法则基因的组成、空间结构和碱基互补配对方式相同基因的组成、空间结构和碱基互补配对方式相同所有生物共用一整套所有生物共用一整套遗传密码遗传密码基因工程第3章 基因工程重组DNA技术的基本工具01基因工程的基本操作程序02基因工程的应用03蛋白质工程的原理和应用04为了棉花姓“中国”19921992年，一场史无前例的棉铃虫灾害以迅雷不及掩耳之年，一场史无前例的棉铃虫灾害以迅雷不及掩耳之势吞噬着中
7、国的棉田，我国棉花产业遭遇灭顶之灾；势吞噬着中国的棉田，我国棉花产业遭遇灭顶之灾；国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术，到国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术，到19991999年外国抗虫年外国抗虫棉已占领我国棉已占领我国95%95%的棉花市场份额，国内棉花品种市场迅速的棉花市场份额，国内棉花品种市场迅速流失。流失。19981998年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新品种品种中棉所中棉所2929，使低龄棉铃虫的死亡率超过，使低龄棉铃虫的死亡率超过90%90%；20022002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫
8、棉新品种中棉所中棉所4141，该品种能够缓解棉铃虫抗药性，该品种能够缓解棉铃虫抗药性;20172017年年1010月月1313日日,农业部种子管理局副局长吴晓玲在回农业部种子管理局副局长吴晓玲在回答媒体提问时表示答媒体提问时表示,目前中国自主选育的转基因棉花品目前中国自主选育的转基因棉花品种市场份额占到种市场份额占到95%95%以上以上,国外品种不到国外品种不到5%5%。从社会中来苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫基因抗虫基因普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)棉花细胞棉花细胞(含抗虫基因含抗虫基因)与运载体与运载体DNADNA拼接，导入拼接，导入棉花植株棉花植株(有抗虫特性有抗虫特
9、性)表达表达 抗虫基因抗虫基因（BTBT毒蛋白基因）毒蛋白基因）如何获得抗虫棉？需要什么工具？3.1 重组DNA技术的基本工具（三）分子运输车-载体（一）分子手术刀-限制性内切核酸酶（二）分子缝合针-DNA连接酶“手术刀手术刀”“缝合针缝合针”“运输车运输车”1.来源：从微生物（从微生物（主要是主要是原核生物原核生物）体内分离出来）体内分离出来2.功能：能够识别双链能够识别双链DNADNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开，因此具有断开，因此具有专一专一性。性。3.
10、作用部位：磷酸二酯键磷酸二酯键，限制酶只切割，限制酶只切割两个核苷酸之间的磷酸二酯键两个核苷酸之间的磷酸二酯键4.切割结果：切口有两种：黏性末端和平末端切口有两种：黏性末端和平末端限制性内切核酸酶一磷酸二酯键磷酸二酯键你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？原原核核生生物物容容易易受受到到自自然然界界外外源源DNADNA的的入入侵侵，所所以以它它在在长长期期的的进进化化过过程程中中形形成成了了一一套套完完善善的的防防御御机机制制。限限制制酶酶就就是是它它的的一一种种防防御御性性工工具具。当当外外源源DNADNA入入侵侵时时，它它会会利利用用限限制制酶酶来来切切割割外
11、外源源DNADNA，使使之之失失效效，以以保保证自身证自身的的安全安全。为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNADNA降降解掉。生物在长期的演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其解掉。生物在长期的演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNADNA分子中或者不具分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制
12、酶，也不会使自基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的身的DNADNA被切断，并且可以防止外源被切断，并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。限制性内切核酸酶一思考讨论1：仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？限限制制酶酶所所识识别别的的序序列列的的特特点点是是：呈呈现现碱碱基基互互补补对对称称，无无论论是是6 6个个碱碱基基还还是是4 4个个碱碱基基，都都可可以以找找到到一一条条中中心心轴轴线线，中中轴轴线线两两侧侧的的双双链链DNADNA上上的的碱碱基基是是反反向向对对称称重重复复排排列列的的 ，称为，称为回文序列回文序列。EcoREcoR5
13、5G-A-A-T-T-G-A-A-T-T-CC3 33 3C-T-T-A-A-C-T-T-A-A-G5G5SmaSma5 5C-C-C-G-G-C-C-C-G-G-GG3 33 3G-G-G-C-C-G-G-G-C-C-C5C5BamHBamH 5 5G-G-A-T-C-G-G-A-T-C-CC3 33 3C-C-T-A-G-C-C-T-A-G-G5G5TaqTaq5 5T-C-G-T-C-G-AA333 3A-G-C-A-G-C-T5T5限制性内切核酸酶一写出下列限制酶切割形成的黏性末端思考：你从中发现什么现象了？思考：你从中发现什么现象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端不同的限制酶
14、可能切割形成相同的黏性末端限制性内切核酸酶一GGGCCCCCCGGG例：限制性例：限制性EcoRIEcoRI的识别序列和切点是的识别序列和切点是G GAATCCAATCC，限制性限制性SmaISmaI的识的识别序列和切点是别序列和切点是GGGCCCGGGCCC。补充完整切割过程图：补充完整切割过程图：GCTTAAAATCC GGAATCCCCTAAGEcoRI黏性末端黏性末端掌握：末端的正确书写GGGCCCCCCGGGSma I平末端平末端练：限制性练：限制性BamHIBamHI的识别序列和切点是的识别序列和切点是G GGATGATCCCC,限制性限制性Bg1Bg1的识的识别序列和切点是别序列
15、和切点是A AGATCTGATCT,分析两种酶切出的末端。分析两种酶切出的末端。15怎样的就为相同末端？怎样的就为相同末端？1 1）BapBap识别序列识别序列AATTAATT，在，在A A与与T T之间切割，则其与之间切割，则其与SmaSma作用作用 后后的末端能进行连接么？的末端能进行连接么？2 2）EcoREcoR识别序列识别序列GAATTCGAATTC，MunMun识别序列识别序列CAATTGCAATTG 并在并在 C C与与A A之间进行切割，之间进行切割，请问这两种酶切成的末端相同不？请问这两种酶切成的末端相同不？平末端都为相同的末端，可连接。但连接后有可能不是回文序列。平末端都为
16、相同的末端，可连接。但连接后有可能不是回文序列。黏性末端（单链片段）能两两互补结合，为相同的末端，可连接。黏性末端（单链片段）能两两互补结合，为相同的末端，可连接。反之则不是。反之则不是。理解：末端是否相同G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A G A A T T C GG C T T A A 用同种限制酶切割用同种限制酶切割(EcoEcoEcoEcoR)R)R)R)把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？缺口怎么办？DNA连接酶“分子缝合针”2.分类：二将将双链双链DNADNA片段片段“缝合缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核起来，恢复被限
17、制酶切开的两个核苷酸之间的苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键，形成重组，形成重组DNADNA分子。分子。1.作用:类型来源来源功能功能相同点相同点差别差别EcoliDNAEcoliDNA连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T T T4 4 4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚
18、合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶相同点相同点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象作用结果作用结果用途用途都能催化形成磷酸二酯键都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要DNADNA的一条链作模板的一条链作模板形成完整的重组形成完整的重组DNADNA分子分子形成形成DNADNA的一条链的一条链基因工程基因工程DNADNA复制复制只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连接连接到已有的到已有的DNADNA片段上，片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键在在两个两个DNADNA片段之间片段之间形成磷酸二酯键形成
19、磷酸二酯键与与DNADNA聚合酶的比较：聚合酶的比较：DNA连接酶“分子缝合针”二与与DNADNA相关的五种酶的比较相关的五种酶的比较名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键磷酸二酯键将将DNADNA切成两个切成两个片段片段DNA连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键将两个将两个DNADNA片段片段连接为一个连接为一个DNADNA分子分子DNA聚合酶磷酸二酯键磷酸二酯键将将单个脱氧核苷酸单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键磷酸二酯键将将DNADNA片段水解为片段水解为单个脱氧核苷酸单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间碱基对之间的氢键的氢键将双链将双链DNADNA分子局部解旋为
20、分子局部解旋为单链单链，形成，形成两条长链两条长链DNA连接酶“分子缝合针”二基因进入受体细胞的载体“分子运输车”三1.作用:2.作为运载体需具备的条件:3.种类将目的基因转移到受体细胞中去将目的基因转移到受体细胞中去利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制能够在宿主细胞中自我能够在宿主细胞中自我复制复制并稳定并稳定保存保存 有有1 1个个至至多个多个限制酶切点，以便与限制酶切点，以便与外源基因外源基因连接连接具有标记基因，便于进行具有标记基因，便于进行筛选筛选对受体细胞无害对受体细胞无害种类用途不同点质粒、噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入大
21、肠杆菌等受体细胞将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结构、复制来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源方式以及可以插入外源DNADNA片段片段的大小也有很大差别的大小也有很大差别基因进入受体细胞的载体“分子运输车”三最常用的载体质粒:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。DNADNA分子复制的起点分子复制的起点有一个或多个限制酶酶切位点有一个或多个限制酶酶切位点有标记基因有标记基因用于鉴别用于鉴别和和筛选含有筛选含有
22、目的基因的受体细胞目的基因的受体细胞抗生素的抗性基因荧光蛋白基因基因进入受体细胞的载体“分子运输车”三噬菌体或动植物病毒作为运载体的原理是：病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。利用病毒对宿主细胞的侵染性利用病毒对宿主细胞的侵染性物种（物种（组织组织）特异）特异若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。噬菌体噬菌体噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕限制酶限制酶DNA连接酶连接酶载体载体对受体细胞无害；对受体细胞无害；有一个至多个限制酶切割位点；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因；有特殊的标记基因；
23、能自我复制或能整合到宿主能自我复制或能整合到宿主DNADNA上。上。质粒、质粒、噬菌体、动植物病毒噬菌体、动植物病毒小结小结基基因因工工程程的的基基本本工工具具作为载体作为载体的条件的条件种类:磷酸二酯键磷酸二酯键来源：来源：主要来源于原核生物主要来源于原核生物特点：特点：作用部位：作用部位：具有专一性具有专一性结果：结果：形成黏性末端或平末端形成黏性末端或平末端连接部位：连接部位：磷酸二酯键磷酸二酯键 种类：种类：E.coliDNA E.coliDNA连接酶、连接酶、T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶作用：作用：把两条双链把两条双链DNADNA片段拼接起来片段拼接起来 2.实验原理：探
24、究实践DNA的粗提取与鉴定（1 1）DNADNA不溶于酒精不溶于酒精，但，但某些蛋白质溶于酒精某些蛋白质溶于酒精。（2 2）DNADNA在不同浓度的在不同浓度的NaClNaCl溶液中溶解度不同溶液中溶解度不同，能，能溶溶于于2mol/L NaCl2mol/L NaCl溶液溶液。（3 3）在一定温度下，）在一定温度下，DNADNA遇遇二苯胺试剂二苯胺试剂会呈现会呈现蓝色蓝色。00.14NaCINaCI浓度浓度（mol/Lmol/L）D DN NA A溶溶解解度度1.实验设计思路：四DNADNA、RNARNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，
25、可以利，可以利用这些差异，用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNADNA进行进行提取提取。3.3.方法步骤方法步骤探究实践DNA的粗提取与鉴定四 DNADNA含量相对较高含量相对较高的生物组织，如的生物组织，如新鲜洋葱新鲜洋葱、香蕉、菠菜、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。菜花和猪肝等。不能选择不能选择哺乳动物成熟的红细胞哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红，因为哺乳动物成熟的红细胞中细胞中没有细胞核和线粒体没有细胞核和线粒体，几乎，几乎不含不含DNADNA。3.选材：注意：4.试剂：研磨液研磨液体积分数为体积分数为95%95%的酒精的酒
26、精2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液溶液二苯胺试剂二苯胺试剂蒸馏水蒸馏水含有含有NaClNaCl、EDTAEDTA、SDSSDS、TrisTris和和HClHCl析出析出DNADNA溶解溶解DNADNA鉴定鉴定DNADNA，要现配现用，要现配现用5.5.方法步骤方法步骤探究实践DNA的粗提取与鉴定四析出析出DNADNADNADNA的鉴定的鉴定研磨研磨称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。过滤取过滤取上清液上清液在漏斗中垫上纱布，在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在到烧杯中，在44冰冰箱中放置几分钟后，箱中放置几分钟后，再取上清液
27、。再取上清液。在上清液中加入体积相等的、在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液预冷的酒精溶液(体积分数为体积分数为95%95%)，静置，静置2 23min3min，溶液中，溶液中出现的白色丝状物就是粗提出现的白色丝状物就是粗提取的取的DNADNA。用玻璃棒沿一个方。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；滤纸吸去上面的水分；取两支试管，各加入取两支试管，各加入2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液溶液5mL5mL。将丝状物或沉淀物溶于其将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的中一支试管的NaCNaCl l溶液中。溶液中。然后，向两支试管中各加然
28、后，向两支试管中各加入入4mL4mL的的二苯胺试剂二苯胺试剂。混。混合均匀后，将试管置于合均匀后，将试管置于沸沸水中水中加热加热5min5min。方法步骤方法步骤 （视频）（视频）探究实践DNA的粗提取与鉴定四注意事项注意事项1 1以血液为实验材料时，每以血液为实验材料时，每100 mL100 mL血液中需要加入血液中需要加入3 g3 g柠檬酸钠柠檬酸钠，防止血防止血液凝固液凝固。2.2.利用动物细胞提取利用动物细胞提取DNADNA破碎细胞的方法：破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破水涨破。3 3加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的
29、加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNADNA量就会减少。量就会减少。4 4加入酒精和用玻璃棒搅拌时，加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓动作要轻缓，以免加剧以免加剧DNADNA分子的断裂，分子的断裂，导致导致DNADNA分子不能形成絮状沉淀分子不能形成絮状沉淀。5 5预冷的酒精具有以下优点：预冷的酒精具有以下优点：可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNADNA降解；降解；抑制分子运动，使抑制分子运动，使DNADNA易形成沉淀析出；易形成沉淀析出；低温有利于增加低温有利于增加DNADNA分分子的柔韧性，减少其断裂。子的柔韧性，减少其断裂。
30、探究实践DNA的粗提取与鉴定四刑侦破案刑侦破案拓展：DNA提取的应用基因组测序基因组测序插入人胰岛素基因插入人胰岛素基因的大肠杆菌的大肠杆菌基因工程基因工程亲子鉴定亲子鉴定探究实践DNA的粗提取与鉴定四1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。结果分析与评价结果分析与评价 观察提取的观察提取的DNADNA的颜色，的颜色，如果不是白色丝状物，说明如果不是白色丝状物，说明DNADNA中的杂质较中的杂质较多多。二苯胺试剂鉴定。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明
31、实验基本成功呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的能的原因有所提取的DNADNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。等。本实验粗提取的本实验粗提取的DNADNA可能仍然可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质含有核蛋白、多糖等杂质。探究实践DNA的粗提取与鉴定四进一步探究进一步探究 实验室提取纯度较高的实验室提取纯度较高的DNADNA的方法有不少。例如，的方法有不少。例如，可以先可以先添加质量分数为添加质量分数为25%25%的的SDSSDS溶液，使蛋白质变性后与溶液，使蛋白质变性后与DNADNA分开分开；随后，加入氯仿
32、随后，加入氯仿异丙醇混合液异丙醇混合液(体积比为体积比为2424：1)1)，通过离心，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。直至上清液变成透明的黏稠液体。此外此外由于苯酚可以迅速使蛋由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时后离心分层，这时DNADNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开层中，用吸管、微量移液
33、器等实验用具就可以将两者分开。探究实践DNA的粗提取与鉴定四练习与应用一、概念检测1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是A.大肠杆菌的质粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用来识别特定基因的DNA探针CA练习与应用二、拓展应用1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本
34、身的DNA分子?提示：迄今为止。在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制
35、酶Hind、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。练习与应用（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接?为什么?XbaXba。因为。因为XbaIXbaI与与SpeISpeI切割产生了相同的黏性末端。切割产生了相同的黏性末端。2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶Hind、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义?提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能
36、切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。练习与应用用限制酶切割时需注意的事项(1)获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。(3)选择限制酶切割位点的基本原
37、则：切割目的基因时：。切割质粒时：。为了产生相同的黏性末端，便于连接为了产生相同的黏性末端，便于连接两两4 4分别使用分别使用两种限制酶两种限制酶去去切割目的基因和运载体切割目的基因和运载体目的基因、质粒的自身环化目的基因、质粒的自身环化以及以及目的基因与质粒反向连接目的基因与质粒反向连接能切下目的基因能切下目的基因且且不破坏目的基因不破坏目的基因至少保留一个完整的至少保留一个完整的标记基因，便于筛选标记基因，便于筛选练习与应用【例】用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是 。构建重组质粒时，最好选择限制酶BamH、Hind处理质粒、外源DNA，这样做的目的是
38、 。SmaSma会破坏质粒中的抗性基因会破坏质粒中的抗性基因以及以及破坏目的基因破坏目的基因确保目的基因确保目的基因与与质粒的质粒的定向连接定向连接练习与应用如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线 用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是 （从“EcoR”、“BamH/Hind”、“Sma/Hind”中选择）不能选择其他限制酶的理由分别是：。BamH/HindBamH/Hind若选若选EcoREcoR会破坏质粒的复制原点；若选会破坏质粒的复制原点；若选Sma/HindSma/Hind，则构建的重组质粒没有标，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点记
39、基因或复制原点练习与应用基础知识提问1.1.基因工程的概念？又名？原理？操作水平？优点？基因工程的概念？又名？原理？操作水平？优点？2.2.重组重组DNADNA技术的基本工具？工具酶？技术的基本工具？工具酶？3.3.限制酶的来源？本质？限制酶的来源？本质？作用？作用的化学键？结果？作用？作用的化学键？结果？4.DNA4.DNA连接酶的本质？作用？连接酶的本质？作用？作用的化学键？作用的化学键？种类？种类？各种类的不同（来源，作用）？各种类的不同（来源，作用）？5.5.一个基因从一个基因从DNADNA分子上切下来，需要切分子上切下来，需要切 处，产生处，产生 个黏性末端，个黏性末端，断断 个磷酸二酯键，需要个磷酸二酯键，需要 个水。个水。6.DNA6.DNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶的比较：相同点？不同点（模板，作用过程）？聚合酶的比较：相同点？不同点（模板，作用过程）？7.7.载体的本质？种类？作为载体需要的条件？载体的本质？种类？作为载体需要的条件？8.8.什么是质粒？什么是质粒？9.DNA9.DNA粗提取的原理？鉴定的原理？方法步骤粗提取的原理？鉴定的原理？方法步骤