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1、ICSDB1304邯郸市地方标准DB1304/T4402023犊牛腹泻病原荧光定量检测技术规程2023-08-21发布2023-08-30实施邯郸市市场监督管理局发布DB1304/T4402023前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则规则起草。本文件由河北工程大学提出。本文件起草单位：河北工程大学、邯郸市标准化所。本文件主要起草人：王方方、钟翠红、刘冠慧、石博文、张永英、王书秀、杨利、李萌、吴丽丽、刘辉、何晓玲、袁英、崔濮凡。IDB1304/T4402023犊牛腹泻病原荧光定量检测技术规程1范围本文件规定了双重荧光定量PCR检测犊牛腹泻病原大肠杆
2、菌和微小隐孢子虫的技术要求。本文件适用于犊牛腹泻病原大肠杆菌和微小隐孢子虫的快速检测和流行病学调查，肉牛和奶牛腹泻也可参照执行。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用WS2712007（感染性腹泻诊断标准）3缩略语下列缩略语适用于本文件。3.1PCR：聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)3.2RT-
3、qPCR：荧光定量PCR(Real-timequantitativePCR)3.3PBS：磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline)3.4Ct值：循环阈值(CycleThreshold)3.5DNA：脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)3.6Tm值：解链温度(MeltingTemperature)44样品采集、保存、运输和处理4.1样品采集用棉拭子从犊牛直肠采集粪便，或用一次性手套采集新鲜粪便约20g，装入一次性封口袋。每份样品标记编号、名称、动物来源、动物年龄、采样时间、采集单位或畜主姓名及地址。4.2样品保存和运输采集的样品在2-8条件下保存应不超过
4、72h，长期保存需加入等体积5%重铬酸钾溶液，装入灭菌容器内4保存。样品运输应放在一个不透水、防泄漏的容器内，将上述容器置于结实、不透水和1DB1304/T4402023防泄漏的辅助包装中。冷冻剂放在辅助包装周围，确保样品在48h内送达实验室。4.3样品的预处理4.3.1将经高压灭菌或80-100烘烤20min的60目-100目铜筛网置于无菌漏斗中，放置在固定好的铁架台上，漏斗下端置于50mL离心管中。取10g待检样品（若是成形的粪便应混匀；若粪便含水量高，混匀后取10mL）放入烧杯中，加30mLPBS，玻璃棒或压舌板混匀后经60目-100目铜筛网过滤至离心管中。4.3.2滤液用移液器吸取1.
5、5mL放入2mL离心管中，-20保存，用于DNA提取。4.3.3剩余滤液1500r/min离心10min，弃上清。沉淀加入等体积5%重铬酸钾溶液，装入灭菌容器内4保存备用。5操作程序5.1DNA抽提将保存于2mL离心管中的样品以1500r/min离心5min后，弃上清，沉淀用于DNA的提取，按从粪便中提取DNA的商品化试剂盒说明书进行操作。5.2荧光定量PCR检测5.2.1荧光定量PCR反应体系的配制。在反应混合物配制区进行。从试剂保存盒中取出大肠杆菌和微小隐孢子虫的上下游引物及其探针、2FastFireqPCRPreMix，灭菌超纯水，在室温下融化后，3000r/min离心5s。设定PCR数
6、为n+2，其中n为待检样品数，加上一管阳性对照及一管阴性对照，每个样本测试反应体系配制（见附录B）。计算好各试剂的使用量，加入一个适当体积的离心管中，向其中加入12.5L（n+3）的2FastFireqPCRPreMix,大肠杆菌和微小隐孢子虫上游引物各0.75L（n+3），大肠杆菌和微小隐孢子虫下游引物各0.75L（n+3），探针各0.5L（n+3），5.5L（n+3）的灭菌去离子水并充分混合均匀。向每个定量PCR管中各分装22L，转移至样本处理区。5.2.2加样在样本加样区进行。在各设定的定量PCR管中分别加入7.1制备的未知样本DNA溶液各3L，盖紧管盖后，500r/min离心30s。5
7、.2.3荧光定量PCR扩增反应在样本检测区进行。将本标准7.2.2加样后的PCR管放入荧光定量PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。在96孔板记录或填写被检样品、阳性对照、阴性对照。设定双重荧光定量PCR（探针法）检测大肠杆菌和微小隐孢子虫的反应参数（见附录B）。检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。6结果判定6.1结果分析条件设定检测结果有效的条件需为：同时满足（1）阴性对照FAM通道和HEX通道检测无Ct值；（2）阳性对照FAM通道和HEX通道检测Ct值30。6.2结果判定及描述6.2.1FAM和HEX通道均检测Ct值40，则判定样品为大肠杆菌和微小隐孢子虫混合感染。2DB1304/
8、T44020236.2.2FAM通道Ct值40，HEX通道无Ct值，则判定样品为大肠杆菌感染阳性，微小隐孢子虫感染阴性。6.2.3FAM通道无Ct值，HEX通道Ct值40，则判定样品为大肠杆菌感染阴性，微小隐孢子虫感染阳性。6.2.4FAM通道和HEX通道检测无Ct值，则判定样品为大肠杆菌和微小隐孢子虫感染阴性。7废弃物处理和防止污染的措施废弃物处理和检验过程中防止交叉污染的措施，按照WS/T230-2002中第6章“污染的预防和控制”的规定执行（见附录C）。3DB1304/T4402023AA附录A（规范性附录）试剂的配制A.10.01mol/L7.2磷酸盐缓冲液（PBS）将0.39gNaH
9、2PO4H2O、1.93gNa2HPO47H2O和8.5gNaCl溶解于800mL蒸馏水，用HCI调节溶液的pH值至7.2，加蒸馏水定容至1000mL，在120高压下蒸汽灭菌20min，保存于室温。A.25%重铬酸钾溶液将5g重铬酸钾加入蒸馏水溶解，定容到100mL，并120高压蒸汽灭菌20min，保存于室温。4DB1304/T4402023BB附录B（规范性附录）荧光定量PCR检测引物说明、反应条件及注意事项B.1引物说明分别根据大肠杆菌和微小隐孢子虫16SrRNA和18SrRNA设计荧光定量PCR（探针法）的特异性引物及其探针（分别为FAM和HEX），引物Tm值在55左右。B.2双重荧光定
10、量PCR反应体系2FastFireqPCRPreMix12.5L，大肠杆菌和微小隐孢子虫上、下游引物各0.75L，探针各0.5L，DNA模板3L，加RNase-FreeddH2O至反应体系总体积为25L。大肠杆菌和微小隐孢子虫上游引物、下游引物在所述试剂盒中的使用终浓度均为0.3M，各特异性荧光探针在试剂盒中的使用终浓度均为0.2M。阴性对照选用RNase-FreeddH2O。B.3双重荧光定量PCR反应参数95预变性1min；95变性5s，60退火15s，收集荧光信号，循环95变性5s，60退火15s，收集荧光信号，共40个循环，结束反应；此反应程序可以使两种病原体的特异性引物在较短时间内对
11、目的片段进行高效扩增，节约检测时间，确保了引物与模板特异性结合。B.4使用中的注意事项在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。对于检测过程中，由于错误操作造成样品处理不当或者DNA提取不当，以及结果出现疑向时，可用保存于5%重铬酸钾中的样品，充分混匀后取1.5mL重新进行DNA提取和PCR扩增，以验证结果的可靠性。5DB1304/T4402023CC附录C（规范性附录）检测过程中防止交叉污染的措施C.1制样过程制样工具应清洗干净，120高压下蒸汽灭菌20min，一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应该经
12、过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。C.2检测过程C.2.1PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区和后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“洁净区”到“污染区”单向进行。C.2.2实验过程中，应穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。C.2.3各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。C.2.4所有溶液、水、耗材和器具要120高压下蒸汽灭菌20min，避免核酸和/或核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在20-25贮存的试剂中，可加入0.025%的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。C.2.5含有DNA模板或引物的离心管打开之前，要短暂离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。C.2.6前PCR区，应在PCR操作台中加入PCR反应各组分。C.2.7实验前后，用紫外线消毒以破坏残留的DNA。C.2.8可使用dUTP/UDG法控制污染。_6