《T_CI 121-2023 RNA定量测序技术规程.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《T_CI 121-2023 RNA定量测序技术规程.docx（19页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、学兔兔标准下载ICS07.080CCSC04团体标准T/CI1212023RNA定量测序技术规程ThetechnicalprocedureofRNAquantitativesequencing2023-08-31发布2023-08-31实施中国国际科技促进会发布学兔兔标准下载T/CI1212023目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.15质量控制要求.26RNA核酸样品采集方法.37总RNA核酸样品完整度检测.48RNA建库.59高通量测序仪质控及测序.1210数据分析.12I学兔兔标准下载T/CI1212023前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则
2、第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国国际科技促进会提出并归口。本文件起草单位：深圳承启生物科技有限公司、武汉承启医学检验实验室有限公司、暨南大学、华南理工大学、赛哲生物。本文件主要起草人：张弓、陈洋、余卓、王鑫、卢少华、金静洁、杜红丽、卢红、陈杰。II学兔兔标准下载T/CI1212023RNA定量测序技术规程1范围本文件确立了用于高通量转录组测序的总RNA核酸类样品的转录组测序和质控全流程，包括样本采集、处理、运输、检测和数据产生和质量评估分析全流程。本文件适用于从新鲜动植物组织、新鲜可培养细胞、
3、全血和细菌/真菌等样品中提取的真核生物和原核生物的总RNA样本的测序。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T35537-2017高通量基因测序结果评价要求GB/T40664-2021用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求T/CHIA21.4-2021组学样本处理与数据分析标准第4部分：转录组文库构建3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1高通量基因测序high-throughputgenesequencing区别于传
4、统双脱氧（Sanger）测序，一种能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术，通常一次测序反应能产出不低于100Mb的测序数据。来源：GB/T30989-2014，3.193.2转录组定量测序wholetranscriptomequantitativesequencing是通过新一代测序技术全面测定某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，通过对序列的统计分析确定每种转录本的量。3.3文库library通过生物来源的、人工合成的或克隆技术等所得到的一个重建分子群，如基因组文库、互补DNA文库、噬菌体展示肽文库等。来源：GB/T30989-2014，3.53.4测序片段reads高通量测序平
5、台产生的含有碱基序列和质量值的序列片段。来源：GB/T35890-2018，3.23.5Q30测序数据中，碱基识别质量值为30的碱基识别准确率为99.9%，或错误率为0.1%。来源：GB/T40226-2021，3.64缩略语下列缩略语适用于本文件。RNA：核糖核苷酸（Ribonucleicacid）1样品类型推荐样品量新鲜动物组织200mg新鲜植物组织300mg新鲜培养细胞6310个全血1mL细菌/真菌菌体300mg学兔兔标准下载T/CI1212023DNA：脱氧核糖核苷酸（DeoxyriboNucleicacid）rRNA：核糖体RNA（RibosomalRNA）bp：碱基对（Basepa
6、ir）OD：光密度（Opticaldensity）Trizol：总RNA抽提试剂（TRIpureReagent）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）DNB：DNB纳米球（DNAnanoball）NCBI：美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）RefSeq：RNA参考序列库（RNAreferencesequencescollection）FANSe3：超高精度的高速序列比对算法（FastandAccuratemappingalgorithmforNext-generationSequenc
7、ing,the3rdgeneration）5质量控制要求5.1通用要求5.1.1生物样本及相关数据的使用应遵守区域、国家和国际的伦理规范。5.1.2样本质量要求应通过完整性和样本浓度确定，达到GB/T40664-2021的总RNA样品质量要求。5.1.3用于高通量测序的核酸类样本应根据GB/T35537-2017中4.1和4.2中的碱基测序准确率的要求进行质量控制。5.1.4使用MHCC97H细胞来源的RNA标准品进行转录组测序，对测序仪状态进行评估：按测序仪推荐的上样量进行测序，测序采用PE150模式进行，对第一端数据进行分析，使用FANSe3将reads比对到NCBIrefseq人类标准参
8、考转录组，FANSe3设置参数为-E5-I1，比对率80%，Q3080%，说明仪器和试剂状态良好，可进行待测样品的转录组高通量测序。5.1.5所有使用的化学试剂均要求至少分析纯。5.2动植物组织、培养细胞、全血和细菌/真菌样本量要求根据不同样品类型和不同测序目标准备足量样品，在条件许可情况下，尽量加倍准备样品量，并做好样品备份工作，表1为推荐样品量。表1推荐样品量5.3RNA样品运输要求5.3.1RNA样品如果需要运输，应尽量溶于足量Trizol后运送（Trizol的体积应不小于RNA溶液体积的5倍，并充分混合均匀），尽量送往距离最近的实验室进行后续实验操作。5.3.2如需低温运送，应使用足够
9、多的冰袋和保温盒，保证整个运输过程中的温度。低温运送时不应使用干冰。CC5.3.3空运时可使用普通0冰袋或-20封闭式冰盒，以防止温度过低而使塑料管变脆破裂。应使用旋盖密封管或气密性包装，以免因气压变化造成管盖弹开。5.3.4不同运送距离和时间，推荐运输条件见表2。2样品类型处理方法无细胞溶液（如细胞培养上清、血清，包括已提纯好溶于水的RNA）至少加入溶液体积5倍以上的Trizol，充分混匀。蛋白质浓度特别高时（如血清）建议至少加入10倍以上体积的Trizol。动物细胞（培养细胞）、植物原生质体直接溶于足量Trizol中。动物组织、临床组织块3大块的组织不易溶解，需低温快速剪成或切成0.5mm
10、以下的小块。由于组织离体后RNA会随着时间变化而变化，且RNA更易降解，因此若剪碎时间较长，请在液氮中研磨。Trizol的量要加足，建议按10倍体积来加。部分组织可能较难溶解，可用涡旋振荡器剧烈振荡，或用枪头、玻璃棒、金属棒等碾碎，使其均匀溶于Trizol，无沉淀。骨组织等无机盐含量高的组织块最终无法全部溶解，属正常现象。细菌微量台式离心机3000rpm-6000rpm3min-10min离心收菌，勿使用过高离心力。弃上清，溶于Trizol，可能需要剧烈涡旋振荡或枪头反复吹打才可完全溶解。部分细菌（尤以革兰阳性菌为甚）细胞壁非常厚，难以良好溶于Trizol，造成RNA提取效率极低。遇到这种情况
11、请在收菌后用溶菌酶先进行破壁，再使用Trizol。极端情况下请于低温下使用细菌磨、FrenchPress、Cellcracker等设备进行快速破壁后再溶于Trizol细胞破碎后RNA降解会很迅速，即便是在4C条件下。距离到达时间建议运输条件小于200公里当天常温200公里至1200公里当天常温陆运2天常温，也可加0C冰袋1200公里至2500公里陆运3至4天或空运2天普通0C冰袋大于2500公里空运3天普通0C冰袋陆运7至10天（需谨慎）-20C封闭式冰盒学兔兔标准下载T/CI1212023表2RNA样品推荐运输条件5.4总RNA核酸样本质量要求5.4.1总RNA完整性本文件同时满足高完整度R
12、NA样品和轻微降解RNA样品建库和测序要求。对于高完整度RNA样品，总RNA样本的完整性应符合GB/T40664-2021的要求。通过凝胶电泳分析总RNA的rRNA的28S/18S（真核样品）和23S/16S（原核样品）rRNA比值进行判断，rRNA条带亮度比值接近2:1，rRNA条带明亮完整，说明无明显降解。若样品因较长时间暴露在空气中或反复冻融的轻微降解RNA样品，若经凝胶电泳显示样品的rRNA条带勉强能分辨，28S/18S（真核样品）或23S/16S（原核样品）rRNA亮度比值低于2:1，或有明显拖尾，通常仍可按照本流程获得与未降解样品一致性较高的结果。5.4.2总RNA浓度和纯度样本总
13、RNA浓度应大于1ng/L。RNA样本纯度：OD260/280=1.82.05。提纯后的RNA中应确保无酚类污染，UV吸收光谱最高峰应在260nm3nm。5.5转录组建库样本质量要求对常见的动物、真菌等物种，包括人、鼠、水稻、酵母等，推荐使用的投入总RNA量为10ng-1g。对于如水稻、拟南芥等植物mRNA丰度较低的物种，建议提高投入总RNA量至1g-2.5g。当样本轻微降解可适当增加投入量，总投入量一般不超过2.5g。6RNA核酸样品采集方法6.1样品前处理不同样品种类，样品前处理操作见表3：表3不同种类样品前处理方法，但切记动作要快，3样品类型处理方法植物组织由于植物组织次生代谢产物极其复
14、杂，常含有多糖多酚，不同组织差异极大，因此可先将组织在液氮中碾碎，然后溶于足量Trizol，离心取上清。若提取效率低下，建议采用试剂盒或CTAB法提取RNA，再按无细胞溶液溶于Trizol。学兔兔标准下载T/CI12120236.2总RNA样品提取方法总RNA样品提取方法如下：a)每1000微升Trizol加入0.2mL氯仿，剧烈混匀（可涡旋）15s，室温放置3min，可观察到样品开始分层；Cb)12000g，4离心15min，使样品分成三层；c)小心吸取上层水相，约600L，转移至新的1.5mLEP管中，注意操作时不要吸取到中间层液体；d)加入800L异丙醇，倒置混匀；如样品中RNA很少，可
15、加入1L糖原帮助沉淀；Ce)置于-20静置，如只需测定真核生物中的成熟体mRNA，静置1h；如果需测定原核生物RNAC或真核生物的lncRNA、小RNA等，需静置8h；f)12000g，4离心30min，去除上清液；CCg)加入1mL75%乙醇（需-20提前预冷30min）；h)7500g，4离心5min，去除上清；i)重复步骤6.2g)、6.2h)一次；Cj)去除残留的乙醇，打开管盖，风干约5min至管底无明显液体残留；k)加入无RNA酶的纯水溶解，此步骤得到总RNA样品，置于-80冰箱保存。7总RNA核酸样品完整度检测采用凝胶电泳分析法检测RNA完整度。凝胶电泳检测总RNA样本完整性结果见
16、图1。注：左边第一泳道为指示核酸分子大小的一系列核酸分子，从上到下分子量大小分别为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；其余泳道为真核细胞总RNA样品。样品均为完整度高的总RNA样品，上样量为2g。图1琼脂糖凝胶电泳评估总RNA提取的纯度和完整度4组分投入质量或体积TotalRNA1g10XreactionbufferwithMgCl21LDNaseI，RNase-free1L（1U）RNase-FreeWaterto10L学兔兔标准下载T/CI12120238RNA建库8.1基因组DNA去除RNA易被DNA污染，若不去除基因组DNA容易影响测序质量。需
17、先用DNaseI去除DNA并纯化后再开始后续实验，具体操作如下：a)反应体系见表4；表4DNA去除反应液Cb)37孵育30min；Cc)加入1L50mMEDTA60孵育10min终止DNaseI反应；d)去除基因组后的RNA马上进行mRNA富集。8.2mRNA富集（根据需要，两种方法选其一）8.2.1rRNA去除法富集RNA非真核生物RNA样品或降解严重的RNA样品，推荐采用rRNA去除法对RNA进行富集。使用对应物种的rRNA去除试剂盒富集RNA后，直接进入步骤8.3RNA片段化。8.2.2磁珠法富集RNA一般情况下，完整或轻微降解的真核生物RNA样品推荐使用Vazyme的LibraryPr
18、eparationVAHTSmRNACaptureBeads进行mRNA捕获：Ca)将mRNACaptureBeads从2C-8取出，静置使其温度平衡至室温；b)准备RNA样品：在一个Nuclease-freePCR管中，用Nuclease-freeH2O将0.01g-12.5g总RNA稀释至50L，冰上放置备用；c)涡旋振荡mRNACaptureBeads充分混匀，吸取50L加入到总RNA样品中，用移液器吹打至少10次以彻底混匀；CCCd)将样品置于PCR仪中，655min，255min，4hold，使mRNA结合到磁珠上；e)将样品置于磁力架5min，使mRNA与总RNA分离；小心移除上清
19、；f)将样品从磁力架上取出，用200LBeadsWashBuffer吹打6次以彻底混匀，在磁力架上静置5min，小心移除上清；CCg)将样品从磁力架上取出，用50LTrisBuffer重悬磁珠；用移液器吹打6次以彻底混匀；h)将样品置于PCR仪中，802min，25hold，将mRNA洗脱下来；i)加入50LBeadsBindingBuffer，用移液器吹打6次以彻底混匀；j)室温放置5min，使mRNA结合到磁珠上；k)将样品置于磁力架5min，使mRNA与总RNA分离；小心移除上清；l)将样品从磁力架上取出，用200LBeadsWashBuffer吹打6次以彻底混匀，在磁力架上静置5min
20、，小心移除全部上清；Cm)加入12LNuclease-freeH2O，用移液器吹打6次充分混匀，将样品置于PCR仪中，802min，立即置于磁力架上5min，待溶液澄清后，小心吸取10L上清至一个新的Nuclease-freePCR管中；n)剩余的2L于NanoDrop仪器检测mRNA富集后浓度，一般浓度大于0.5ng/L都可进入后续RNA文库构建；Co)mRNA富集后样品可置于-20短暂保存，建议立即进入RNA文库构建。8.3RNA片段化5温度时间热盖on16C60min4CHold*不建议停止在此步骤，会降低产物回收效率，继续做完二连产物纯化后方可停止实验。温度时间热盖on25C10min
21、42C30min70C15min4CHold组分体积RTBuffer5LRTEnzymeMix1LTotal6L组分体积SecondStrandBuffer26LSecondStrandEnzymeMix4LTotal30L插入片段片段化条件片段化时间150bp94C8min250bp87C6min兔学兔标准下载T/CI1212023若计划使用基于桥式PCR扩增与边合成边测序结合的测序技术平台对mRNA文库进行二代测序应将步骤8.3至8.10替换为T/CHIA21.4-2021中4.1.3至4.1.9章节中的普通转录组建库流程进行；本流程基于MGIEasymRNA文库制备试剂盒进行标准文库构建
22、，最终将使用基于DNA纳米球与联合探针锚定聚合技术结合的测序技术平台对mRNA文库进行二代测序。其他二代测序技术与之大同小异，可参照执行。a)向mRNA富集后的10L洗脱液中加入4LFragmentationBuffer吹打10次混匀，瞬时离心后放入PCR仪中；b)根据插入片段大小的需要，选择相对应的片段化条件，片段化条件见表5。表5片段化条件推荐8.4反转录以及二链合成C8.4.1将RTBuffer从-20取出，解冻后颠倒混匀，在冰上配制反转录反应液，反应液体系见表6。表6反转录反应液8.4.2用移液器吸取6L配制好的反转录反应液加入上一个步骤的片段化后产物中吹打10次混匀，瞬时离心将反应液
23、收集至管底。8.4.3按照表7中的反应条件在PCR仪中进行反应。表7反转录反应条件8.4.4反应结束后，将产物置于冰上，瞬时离心10s。C8.4.5将SecondStrandBuffer从-20取出，解冻后颠倒混匀，在冰上配制二链合成反应液，反应液体系见表8。表8二链合成反应液8.4.6用移液器吸取30L配制好的二链合成反应液加入到上一步骤的反转录产物中吹打10次混匀，瞬时离心将反应液收集至管底。8.4.7按照表9反应条件在PCR仪中进行反应。表9二链合成反应条件6温度时间热盖on37C30min65C15min4CHold组分体积ERATBuffer7.1LERATEnzymeMix2.9L
24、Total10L组分体积Adapter2LTEBuffer8LTotal10L兔学兔标准下载T/CI12120238.4.8反应结束后，瞬时离心10s，将二链产物转移至新的1.5mL离心管中，置于冰上待下步反应。8.5二链产物纯化8.5.1提前30min取出DNACleanBeads置于室温，使用前充分震荡混匀。8.5.2用移液器吸取75LDNACleanBeads至步骤8.4.8中的二链产物中并轻轻吹打至少10次以混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入1.5mL离心管。8.5.3室温孵育5min。8.5.4瞬时离心，将1.5mL离心管置于磁力架，静置5min至液体澄清，用移液器小心
25、吸取并丢弃上清。8.5.5保持1.5mL离心管置于磁力架上加入200L新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁静置30s后小心吸取并丢弃上清。8.5.6重复8.5.5步骤尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干。8.5.7持1.5mL离心管固定于磁力架上，打开1.5mL离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。8.5.8将1.5mL离心管从磁力架上取下加入42LTEBuffer进行DNA洗脱用移液器轻轻吹打至少10次以混匀，瞬时离心。8.5.9室温下孵育5min。8.5.10将1.5mL离心管置于磁力架上静置2min-5min至
26、液体澄清将40L上清液转移到新的0.2mLPCR管中。C8.5.11停止点：二链产物纯化后，可置于-20冰箱储存。8.6末端修复及添加dA尾8.6.1在冰上配制末端修复及添加dA尾反应液，反应液体系见表10。表10末端修复及添加dA尾反应液8.6.2用移液器吸取10L配制好的末端修复&添加dA尾反应液加入步骤8.5.10的纯化后二链产物中并轻轻吹打至少10次以混匀，瞬时离心将反应液收集至管底。8.6.3按照表11反应条件在PCR仪中进行反应。表11末端修复及添加dA尾反应条件C8.6.4瞬时离心将反应液收集至管底。不建议在此处停止，请继续做步骤8.7如果必须停止，末端修复产物可以放在-20冰箱
27、过夜，但产量可能下降20%左右。8.7接头连接8.7.1TotalRNA为1g所以接头应该稀释5倍使用，反应液体系见表12：表12Adapter稀释7组分体积LigationBuffer23.4LDNALigase1.6LTotal25L温度时间热盖on23C30min4CHold学兔兔标准下载T/CI12120238.7.2在步骤8.6.4的PCR管中加入5L对应的稀释后的Adapter，用移液器轻轻吹打至少10次以混匀，瞬时离心将反应液收集至管底。8.7.3在冰上配制接头连接反应液，反应液体系见表13：表13接头连接反应液8.7.4用移液器缓慢吸取25L配制好的接头连接反应液加入步骤8.7
28、.2的PCR管中用移液器轻轻吹打至少10次以混匀，瞬时离心将反应液收集至管底。8.7.5按照表14反应条件进行在PCR仪中进行反应，反应体系见表14：表14接头连接反应条件8.7.6瞬时离心将反应液收集至管底。C8.7.7加入20LTEBuffer至总体系100L，全部转移到新的1.5mL离心管中。接头连接后产物可放置-20冰箱过夜储存，不超过16h。8.8连接产物纯化8.8.1插入片段为150bp（RNA片段化条件为94C，8min）的纯化方法8.8.1.1提前30min取出DNACleanBeads置于室温，使用前充分震荡混匀。8.8.1.2用移液器吸取50LDNACleanBeads至步
29、骤8.7.7中的二链产物中并轻轻吹打至少10次以混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入0.2mLPCR管中。8.8.1.3室温孵育5min。8.8.1.4瞬时离心，将PCR管置于磁力架，静置5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。8.8.1.5保持PCR管置于磁力架上加入200L新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁静置30s后小心吸取并丢弃上清。8.8.1.6重复8.8.1.5步骤尽量吸干管内液体，保持PCR管固定于磁力架上，打开管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。8.8.1.7将PCR管从磁力架上取下加入52LTEBuffer进行DNA洗脱用移液器轻轻吹打至少10次以
30、混匀，瞬时离心，室温下孵育5min。C8.8.1.8将PCR管置于磁力架上静置5min至液体澄清将50L上清液转移到新的0.2mLPCR管中。连接产物纯化后，可置-20冰箱储存。8.8.2插入片段为250bp（RNA片段化条件为87C，6min）的纯化方法8.8.2.1用移液器吸取32.5LDNACleanBeads至步骤8.8.1.8中的50L上清产物中并轻轻吹打至少10次以混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入0.2mLPCR管中，室温下孵育5min。8.8.2.2瞬时离心，将PCR管置于磁力架上静置5min至液体澄清将80L上清液转移到新的0.2mLPCR管中。8.8.2.3用
31、移液器吸取10LDNACleanBeads至步骤8.8.2.2中的80L上清产物中并轻轻吹打至少10次以混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入0.2mLPCR管中，室温下孵育5min。8.8.2.4瞬时离心，将PCR管置于磁力架，静置5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。8.8.2.5保持PCR管置于磁力架上加入200L新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁静置30s后小心吸取并丢弃上清。8.8.2.6重复步骤8.8.2.5尽量吸干管内液体，保持PCR管固定于磁力架上，打开管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。8温度时间循环数热盖on1循环95C3min95C30s10-
32、14循环（1gTotalRNA设置12或13个循环）56C30s72C1min72C5min1循环4CHold组分体积PCREnzymeMix25LPCRPrimerMix4LTotal29L学兔兔标准下载T/CI12120238.8.2.7将PCR管从磁力架上取下加入23LTEBuffer进行DNA洗脱用移液器轻轻吹打至少10次以混匀，瞬时离心，室温下孵育5min。C8.8.2.8将PCR管置于磁力架上静置5min至液体澄清将21L上清液转移到新的0.2mLPCR管中。连接产物纯化后，可置-20冰箱储存。8.9PCR扩增8.9.1在冰上配置PCR反应液如表15所示。表15PCR反应液8.9.
33、2用移液器吸取29L配制好的PCR反应液加入步骤8.8.2.8的PCR管中，用移液器轻轻吹打至少10次以混匀，瞬时离心将反应液收集至管底。8.9.3按照表16反应条件进行在PCR仪中进行反应：表16PCR扩增反应条件8.9.4瞬时离心将反应液收集置管底，吸取全部反应液转移到新的PCR管中。8.9.5PCR产物质控：取1LPCR产物琼脂糖凝胶电泳查看PCR产物片段大小以及文库浓度（图2），若插入片段为250bp则PCR产物主片段在330bp左右，插入片段为150bp则PCR产物主片段在230bp左右，条带颜色均匀，说明不用继续加PCR循环数。注：左边第一泳道为指示核酸分子大小的一系列核酸分子，从
34、上到下分子量大小分别为：500bp、400bp、300bp、200bp、150bp、100bp和50bp；其余泳道为PCR产物。图2PCR产物质检8.10PCR产物纯化8.10.1提前30min取出DNACleanBeads置于室温，使用前充分震荡混匀。8.10.2用移液器吸取60LDNACleanBeads至步骤8.9.4中的PCR产物中并轻轻吹打至少10次以9插入片段主片段大小（bp）PCR产物主片段大小（bp）1pmol对应产量（ng）150230152250330218组分体积SplintBuffer11.6LDNARapidLigase0.5LTotal12.1L温度时间热盖on37C30min4CHold温度时间热盖on95C3min标准学兔兔下载T/CI1212023混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入0.2mLPCR管中。8.10.3室温孵