《DB32_T 4539-2023 淡水生物环境DNA监测技术方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DB32_T 4539-2023 淡水生物环境DNA监测技术方法.docx（28页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、ICS13.020CCSZ06DB32/T45392023淡水生物环境DNA监测技术方法TECHNICALMETHODFORENVIRONMENTALDNAMONITORINGOFFRESHWATERORGANISMS20230922发布20231022实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T45392023目次前言1范围12规范性引用文件13术语和定义14监测点位布设35监测频次与时间46试剂和材料47仪器和设备58环境DNA宏条形码监测内容和方法59质量控制与质量保证910废弃物处理10附录A（资料性）环境DNA固定剂11附录B（资料性）常用淡水生物DNA条形码扩增引物信息12附录C（规范
2、性）淡水生物DNA条形码构建方法14附录D（资料性）生物统计表17附录E（规范性）野外质量控制与保证18附录F（规范性）实验室质量控制与保证19参考文献21DB32/T45392023前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省生态环境厅提出并归口。本文件起草单位：江苏省环境监测中心、南京大学。本文件主要起草人：张咏、张效伟、杨雅楠、杨江华、蔡琨、王晨波、吕学研、李婧慧、张丽娟、钟文军、侍昊、朱晨、毛成责、卜亚谦、范帆。DB32/T45392023淡水生
3、物环境DNA监测技术方法1范围本文件规定了利用环境DNA技术监测淡水生物的采样、试剂和材料、仪器和设备、监测内容和步骤，以及质量控制与保证。本文件适用于生态环境监测领域湖泊、水库、溪流、河流、河口区等水域浮游植物、浮游动物、着生藻类、大型底栖无脊椎动物和鱼类等淡水生物物种组成及相对丰度的监测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T20001.4标准编写规则第4部分：试验方法标准GB/T298
4、59生物信息学术语GB/T30989高通量基因测序技术规程GB/T34265SANGER法测序技术指南GB/T35890高通量测序数据序列格式规范GB/T37874核酸提取纯化方法评价通则GB/T40226环境微生物宏基因组检测高通量测序法HJ91.2地表水环境质量监测技术规范HJ494水质采样技术指导HJ710.7生物多样性观测技术导则内陆水域鱼类HJ710.8生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物HJ1216水质浮游植物的测定0.1ML计数框显微镜计数法HJ1295水生态监测技术指南河流水生生物监测与评价（试行）HJ1296水生态监测技术指南湖泊和水库水生生物监测与评价（试行）SC/
5、T9402淡水浮游生物调查技术规范SN/T4835实验室生物废弃物管理要求DB21/T2777海洋浮游微藻分离和筛选技术规程DB32/T4178河流水生态监测规范3术语和定义GB/T20001.4、GB/T29859和GB/T30989界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1淡水生物FRESHWATERORGANISMS生活在各类淡水生境中的生物。1DB32/T45392023注：主要的淡水生物类群包括浮游植物、浮游动物、大型底栖无脊椎动物和鱼类等。3.2环境DNAENVIRONMENTALDNA；EDNA环境介质（水、土壤、沉积物、生物膜、空气等）或混合生物组织中存在的脱氧核糖核酸（DN
6、A）等生物遗传物质。3.3DNA条形码DNABARCODE生物体细胞核或者细胞器中能够代表该物种的、有足够变异的、易扩增的短DNA序列，可用于物种的识别和鉴定。来源：SN/T42782015，3.1，有修改3.4引物PRIMER在DNA复制过程中，结合于模板链上并提供DNA合成起点，具有一定长度和顺序的寡核苷酸链。3.5聚合酶链式反应POLYMERASECHAINREACTION；PCR一种体外酶促合成特异DNA片段的分子技术，由高温变性、低温退火及适温延伸等组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便省时等特点。3.6SANGER测序SANGERSEQU
7、ENCING用于基因测序的双脱氧末端终止法，在链延伸过程中利用荧光标记双脱氧碱基随机阻断，产生以A/T/G/C结束的四组不同长度的核苷酸链，通过读取荧光信号实现对核酸碱基序列信息的读取。3.7遗传距离GENETICDISTANCE群或分类单元间的遗传差异程度，可以通过遗传标记如DNA条形码的序列差异来表示。3.8高通量测序HIGHTHROUGHPUTSEQUENCING区别于传统SANGER（双脱氧链末端终止法）测序，能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术。来源：GB/T309892014，3.19，有修改3.916S核糖体DNA16SRIBOSOMALDNA；16SRDNA原核生物
8、编码核糖体小亚基RRNA的DNA序列。3.1018S核糖体DNA18SRIBOSOMALDNA；18SRDNA真核生物编码核糖体小亚基RRNA的DNA序列。3.11线粒体12S核糖体DNAMITOCHONDRIAL12SRIBOSOMALDNA；MT12SRDNA后生动物线粒体编码12SRRNA的DNA序列。3.12线粒体细胞色素C氧化酶IMITOCHONDRIALCYTOCHROMECOXIDASEI；COI后生动物线粒体编码细胞色素C氧化酶I的DNA序列。3.13DNA宏条形码DNAMETABARCODING利用高通量测序获取环境DNA中特定的DNA片段，根据DNA序列差异识别物种，获取物
9、种组成2DB32/T45392023和群落结构。3.14标签TAG通过PCR或文库准备过程中为每个样品添加一个短序列的核苷酸碱基对，允许多个样品在一个高通量测序运行中被汇集。注：这个序列对于同一个运行中的每个样本都是不同的，并使序列能够在测序后分配回它们来自的样本。3.15序列相似性SEQUENCESIMILARITY反映序列间相似程度的数值，即序列间相同DNA碱基数目所占的比例。注：一般以百分数表示。来源：SN/T42782015，3.8，有修改3.16序列相似性阈值CUTOFFVALUEOFSEQUENCESIMILARITY判定两条DNA序列是否为同一分类单元的最小序列相似值。3.17扩
10、增序列变体AMPLICONSEQUENCEVARIANTS；ASVDNA宏条形码技术中，通过生物信息学剔除PCR扩增和测序产生的错误序列后形成的独特DNA序列，即任意两条序列间至少有一个碱基存在差异。3.18操作分类单元OPERATIONALTAXONOMICUNIT；OTUDNA宏条形码测序数据按照一定的序列相似性阈值进行聚类，获得的用于表征物种的分子水平分类单元。3.19相对丰度RELATIVEABUNDANCE样品中分配到某一分类单元的序列数占该样品序列总数的比例。来源：GB/T402262021，3.2，有修改3.20阴性质控样本NEGATIVECONTROLSAMPLE确定不含特定物
11、种或者所有物种的样本（例如无菌水），与待测样本同步试验，用于判断待测样本是否被污染。3.21阳性质控样本POSITIVECONTROLSAMPLE已确定物种组成的样本，与待测样本同步试验，用于判断测序结果是否可靠。4监测点位布设4.1通则按照HJ91.2设置环境DNA采样点位，应遵循连续性、一致性、代表性和可行性原则。结合环境DNA的时空分布特征，综合考虑监测类群的生态和生活史特征、水体类型、大小、深度、分层、连通性、基质、温度、水文和水化学等因素的影响。注：生活污水中可能含有残留的生物DNA，采样位点布设要尽量避免污水排放渠和污水处理厂，并详实记录。3DB32/T453920234.2溪流、
12、河流点位布设按照HJ1295的规定设置监测断面，每个断面设置不少于3个代表性点位。在缓慢流动的低地溪流和河流中，宜间隔1KM设置采样点。在快速流动的高山溪流和河流中，采样位点宜间隔10KM以上。应详实记录河流的地形特征（如地形、河岸结构、河床沉积物、人工改造等）、流速、水温、PH值等影响环境DNA扩散的因素。4.3湖泊、水库监测点位布设按照HJ1296的规定设置监测点位，大型湖泊应适当增加监测点位。湖库构成湖库群，当对区域湖库作整体监测时，可适当减少单个湖库的监测点位。宜设置湖库监测点位周边100M的范围内为采样区域。深水型湖泊宜间隔5M深度分层采样。5监测频次与时间5.1监测频次综合考虑水域
13、环境条件、生物类群的时空分布特点、监测目的及人力、费用投入，确定监测频次。可选择季度或月度开展监测，应避开雨水集中的时间。针对重点关注区域、突发环境问题或其他条件下，可开展更高频次的监测。5.2监测时间采样时间宜综合考虑靶向监测类群的生态特征和生活史及水体类型。例如：湖泊、水库，宜考虑生物类群的季节性分层；溪流、河流，宜考虑迁移物种的分布模式（如鱼类洄游）。6试剂和材料6.1超纯水。6.2分析纯无水乙醇。6.3环境DNA固定剂，可参考附录A。6.4DNA提取试剂盒或CTAB法提取DNA所用到的试剂。6.5PCR扩增试剂：用于特异性片段PCR扩增，通常包含缓冲液、扩增酶等。6.6PCR扩增引物：
14、可参考附录B。6.7PCR产物纯化试剂盒：用于PCR产物纯化。6.8DNA浓度测定试剂：用于DNA浓度测定，主要成分包括缓冲液和染色剂。6.9凝胶电泳相关试剂：用于PCR产物凝胶电泳检测，通常包含琼脂糖、电泳缓冲液（TAE）、片段大小标记。6.10文库构建试剂：用于样品的基因文库构建，试剂盒内至少应包含末端修复酶、测序接头、DNA连接酶、缓冲液。6.11高通量测序试剂：用于对测序文库进行高通量基因测序，试剂盒内至少应包含测序引物、测序反应酶、缓冲液。16.12无菌采样瓶或采样袋：L及以上规格。6.13无菌微孔滤膜：0.22M、0.45M、1.2M和5M等。6.14无菌镊子。4DB32/T453
15、92023256.15无菌离心管：1.5ML、ML、10ML，无DNA和生物残留。6.16冻存管：ML，无DNA和生物残留。16.17枪头：10L、200L、000L和5ML等，无DNA和生物残留。6.18PCR管、96孔板等类似的PCR反应容器：无DNA和生物残留。6.19无菌手套。7仪器和设备7.1恒温水浴锅。7.2涡旋振荡器或均质仪。7.3冷冻干燥仪。7.4真空离心浓缩仪。7.5高速冷冻离心机：离心转速可达13000R/MIN，温控范围低至4。7.6微量移液器：0.5L10L、20L200L和100L1000L等。7.7超微量分光光度计：测量体积最小1L，波长范围包括230NM、260N
16、M和280NM。7.8PCR仪。7.9电子天平。7.10水平式核酸电泳仪。7.11凝胶成像分析仪。7.12高通量测序仪。27.13高温高压灭菌器：可达到标准要求的121、21MIN灭菌条件。7.14采水器：L或5L。7.15浮游生物网：25号浮游动物网，孔径64M。7.16着生藻类采集器具：毛刷、刀片、托盘、洗瓶等。D7.17大型底栖无脊椎动物采集装置：如彼得森采泥器、型抄网、踢网、索伯网等。7.18水样抽滤设备：具备-91.2KPA以上的真空抽滤设备。7.19大型底栖无脊椎动物清洗装置：如40目筛网等。7.20超净工作台。7.21低温存储设备：普通冰箱、低温冰箱和超低温冰箱。7.22液氮罐。
17、7.23工作站：运行内存不低于16GB，硬盘存储不低于1TB，处理器不低于8核。7.24高通量测序数据质量控制和分析软件。8环境DNA宏条形码监测内容和方法8.1环境DNA宏条形码监测内容环境DNA宏条形码监测包括环境DNA样品采集、环境DNA提取、宏条形码扩增与测序、生物信息学分析、生物统计表和质量控制与质量保证等过程（见图1）。5生物类群水样沉积物生物膜混合生物组织浮游植物+着生藻类+浮游动物+A大型底栖无脊椎动物+B鱼类+注：+表示可用，+表示较多采用，+表示最为常用。A浮游动物主要通过浮游生物网收集组织DNA。B大型底栖无脊椎动物主要通过采集沉积物中底栖动物组织，进一步通过乙醇浸提法获
18、取组织DNA。DB32/T45392023图1环境DNA宏条形码监测技术流程8.2环境DNA样品采集8.2.1通则根据监测的生物类群，按照表1选择合适的环境DNA采集方法，每个位点采集3个生物重复样品。表1不同生物类群的环境DNA采样介质8.2.2水样水样采集按照HJ494的规定执行，采样体积不宜小于1L。浮游植物监测的水样体积宜为1L，底栖动物和鱼类监测的水样体积宜为3L。现场过滤至一定孔径（一般为0.45M）的滤膜上，高泥沙水样，应低温（4或冰袋保存）静置分离悬浮颗粒物，再过滤。生物密度较高的水体（如处于藻华爆发期），可将水样等体积分开过滤至多张（15）滤膜作为子样本。野外干冰、液氮或-2
19、0保存，实验室-20以下保存；或者加入附录A推荐的固定剂，常温保存。8.2.3沉积物样品按照HJ494的规定采集50ML的表层沉积物（0CM5CM），剔除砾石、木屑、杂草、贝壳及其他大体积生物残体，收集至无菌管中，同一采样点沉积物采集宜涵盖各类小生境（如沉水植被覆盖区等）。野外干冰或-20保存，实验室-20保存；或者加入无水乙醇，确保样品中最终的乙醇浓度80%，低温6DB32/T45392023保存。8.2.4生物膜样品按照DB32/T4178的规定从不同自然基质（如粗砾石、鹅卵石以及树木残干等）表面刮取25CM2样品，无菌水清洗至采样瓶中，野外干冰或-20保存，实验室-20保存；或者加入无水
20、乙醇，确保最终的乙醇体积分数80%，低温保存。8.2.5混合生物组织样品18.2.5.1按照SC/T9402的规定用浮游生物网定量采集浮游动物样品，采样体积不小于20L，过滤至5M孔径滤膜，野外干冰保存，实验室-20保存；或者加入附录A推荐的固定剂，常温保存。8.2.5.2大型底栖无脊椎动物采集与筛选应按照HJ710.8，加入3倍体积的无水乙醇，G换算为1ML，常温保存。8.3环境DNA样品前处理8.3.1滤膜样品（水样/混合浮游动物组织样品）：利用研磨珠和裂解液将滤膜振荡破碎。8.3.2沉积物样品：乙醇保存的样品应高速（不低于12000R/MIN）离心20MIN，留取沉淀物。低温保存的样品可
21、经均质仪均质后冷冻干燥，充分混匀。48.3.3生物膜样品：解冻，振荡混匀，取2ML样品，高速（不低于12000R/MIN）离心20MIN，留取沉淀物。8.3.4混合底栖动物组织样品：室温放置5D，多次振荡混匀，吸取浸出液，真空离心浓缩至乙醇完全去除。8.4环境DNA提取8.4.1DNA提取按照GB/T40226中的操作步骤，借助物理和化学方法充分释放环境介质中蕴含的DNA，并去除样品中的蛋白质、脂类、多糖、RNA等杂质，采用离心柱法和磁珠法等常规分子生物学操作纯化DNA。8.4.2DNA浓度测定与保存，样本DNA质量浓度应不低于1NG/L，最佳质量浓度范围为10NG/L100NG/L260NM
22、和280NM波长处的吸光度值比值（OD260NM/OD280NM）应在1.72.0范围内，OD260NM/OD230NM应大于2.0。DNA平行分装后，应在20及以下温度条件保存，避免反复冻融。8.5宏条形码扩增与测序8.5.1宏条形码扩增8.5.1.1针对不同生物类群选择特异性一对或多对引物扩增目标条形码序列，可在引物序列前添加标签以区分样品。推荐引物参照附录B。8.5.1.2宏条形码产物用1%2%的琼脂糖凝胶电泳检测，应呈现单一清晰明亮、无拖尾的条带。若样品出现多个条带，需纯化PCR产物，纯化过程参考SN/T4278。8.5.1.3条形码扩增产物在-20及以下保存，保存时间一般不超过1年。
23、7DB32/T453920238.5.2高通量测序8.5.2.1宜将含有不同的引物标签的宏条形码扩增产物等摩尔量混合构建测序文库。文库构建起始量应不低于100NG。当文库的片段长度分布符合预期，且文库浓度满足高通量测序要求时，文库质检合格。8.5.2.2将多个质检合格的文库按比例混合，参考GB/T30989和GB/T35537对宏条形码扩增产物进行测序。同一试验样本宜安排在同一批次上机测序。每个样本的预期的有效序列数不宜低于30000条。8.6生物信息学分析8.6.1一般要求同一批试验数据，生物信息学分析流程及关键参数应保持一致。8.6.2序列质量控制双端测序应进行序列合并。通过搜索特定序列（
24、去除测序接头ADAPTOR、样品标签TAG和引物），并基于碱基识别质量（Q20，参考）和序列长度（预期长度的70%，参考）进行序列修剪，确保前端序列长度+后端序列长度两段序列的重叠长度（OVERLAP）目标序列长度。8.6.3文库拆分根据每个样品的标签将序列分配到不同的样品中。8.6.4序列聚类及质量控制8.6.4.1可选用OTU或ASV方法进行序列聚类和或降噪，获得分子分类单元，并过滤掉非目标序列。8.6.4.2OTU方法：将相似性大于或等于阈值（相似性阈值一般为97%）的序列合并成OTUS，将序列比对到每个OTU的代表性序列，获得每个OTU在每个样品中出现的序列数。8.6.4.3ASV方法
25、：每个独特的序列即为一个ASV，根据生物信息学方法过滤潜在的PCR和测序错误的ASV序列，将序列比对到每个ASV，获得每个ASV在每个样品中出现的序列数。8.6.5过滤低丰度的分子分类单元过滤低丰度（如总序列数为15，可能为假阳性、污染序列或未去除的嵌合体）和阴性对照中相对序列丰度超过千分之一的分子分类单元，也可根据实际监测需求调整过滤的丰度阈值。注：嵌合体为PCR扩增中产生的由两种或两种以上序列母体组合的错误序列。8.6.6物种注释将分子分类单元的序列与条形码数据库比对分析，获得物种注释信息。物种注释方法和物种鉴定阈值（主要是序列相似性）的选择，宜综合考虑选用的条形码片段、参考数据库的完整性
26、及数据用途。当参考数据库中不存在目标物种的DNA序列时，按照附录C构建DNA条形码。8.7结果统计8.7.1检出判定分子分类单元在某一位点的生物重复样品中检出率（物种检出的样品数除以总样品数）不应低于2/3。建议每个样品宜保留相对丰度0.01%，出现在两个样点以上的分子分类单元。8操作过程阴性质控样本阳性质控样本过滤无菌水无DNA提取无菌水已知组成的混合群落PCR扩增无菌水已知物种组成的DNA标准样品测序无菌水测序试剂盒中的对照试剂DB32/T453920238.7.2序列相对丰度每个位点检出的分子分类单元的序列相对丰度应为所有生物重复样品中序列相对丰度的平均值。针对相对丰度差异较大的生物重复
27、，宜取几何平均数。8.7.3生物统计表每个样品的生物多样性统计表由分子分类单元（如ASVS或OTUS）名称、序列、物种注释信息、序列数和相对丰度组成，可参考附录D。9质量控制与质量保证9.1质量控制9.1.1质量控制参数9.1.1.1阴性对照在每天的样品采集、同一批次DNA提取和PCR扩增阶段应分别设置不少于3个阴性对照，高通量测序时可适当设置13个测序的阴性对照（见表2）。表2环境DNA宏条形码技术每个流程设置的阴性和阳性对照9.1.1.2阳性对照宜设置不少于6个PCR扩增的阳性对照。PCR扩增的阳性对照应为不少于5个物种的基因组DNA（已知可以有效扩增）的等量混合物，质量浓度一般为1NG/
28、L。也可根据试验需要和试验条件在DNA提取和测序过程中适当设置阳性对照（见表2）。9.1.1.3平行样品每个位点应设置至少3个生物重复样品，可根据试验需求和试验条件适当设置DNA提取、PCR和建库测序平行样品。平行样品的相对丰度取平均值作为位点的相对丰度。9.1.2质量控制评价指标9.1.2.1假阴性率使用PCR扩增的阳性对照评估监测的假阴性率。重复测定6次，计算标准样品中含有但测量结果中未检出的物种所占比例，即假阴性率（FN）。假阴性率不应超过10%。按照公式（1）计算。FN=N1N（1）式中：FN假阴性率；9DB32/T45392023N1标准样品中未被测出的物种数目，单位为个；N标准样品
29、的实际物种数目，单位为个。9.1.2.2假阳性率使用PCR扩增的阳性对照评估监测的假阳性率。重复测定6次，计算测量结果的中标准样品中未包含物种的出现概率，即假阳性率（FP）。假阳性率不应超过10%。按照公式（2）计算。FP=N2N（1）式中：FP假阳性率；N2未在标准样品物种清单的物种数目，单位为个；N标准样品的实际物种数目，单位为个。9.2质量保证9.2.1野外质量保证按照附录E的规定做好野外样品采集、运输与保存，防止样品的交叉污染。9.2.2实验室质量保证试验过程应防止样品的污染，并按照附录F的规定做好数据记录和样品保存。10废弃物处理废弃物的分类、收集、存放和集中处理应按照GB19489
30、和SN/T4835的规定执行，其中生物废弃物在处理之前应采用高压灭菌、消毒或灼烧等方式灭活，对含核酸染料的废液和废胶单独收集和处理。10序号成分浓度体积1TRISHCL1MOL/L100ML2EDTA0.5MOL/L200ML3NACL4MOL/L2.5ML4SDS5G定容双蒸水1LDB32/T45392023附录A（资料性）环境DNA固定剂A.1乙醇固定剂乙醇的体积分数不小于96%，且其中不含甲醇等其他醇类。固定剂需浸没整个样本，样本在乙醇中S可以在常温下稳定储存3个月6个月。乙醇保存样本不可在10以下储存。A.2LONGMIRE固定剂SSSSLONGMIRE固定剂应浸没整个样本。常温下，样
31、本在LONGMIRE中可以稳定储存2周6周。LONGMIRE固定剂在低温下可能会出现沉淀，可适当加热待沉淀溶解再使用。LONGMIRE固定剂配方见表A.1。S表A.1LONGMIRE固定剂配方11目标群落基因名称引物名称引物序列（53）预期长度BP退火温度蓝藻门16S_V316S_341FACCTACGGGRSGCWGCAG100200556216S_518RATTACCGCGGCTGCTGG16S_V416S_515FGTGCCAGCMGCCGCGGTAA300556216S_806RGGACTACHVGGGTWTCTAAT16S_V3_V416S_338FACTCCTACGGGAGGCAG
32、CAG400500556216S_806RGGACTACHVGGGTWTCTAAT23SP23SRV_F1GGACAGAAAGACCCTATGAA4004504952P23SRV_R1TCAGCCTGTTATCCCTAGAG真核藻类18S_V918S_1389FTCCCTGCCHTTTGTACACAC100200556218S_1510RCCTTCYGCAGGTTCACCTAC18S_V4TAREUK454FWD1CCAGCASCYGCGGTAATTCC3004005562TAREUKREV3ACTTTCGTTCTTGATYRA着生硅藻18S_V4DIV4_FGCGGTAATTCCAGCTCC
33、AATAG4005004855DIV4_RCTCTGACAATGGAATACGAATA浮游动物大型底栖无脊椎动物COI1MLCOIINTFGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC3134555DGHCO2198TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA大型底栖无脊椎动物COI2MLCOIINTFGGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC3134555JGHCO2198TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA鱼类MT12SRDNA1METAFISHF1TCGTGCCAGCCACCGCGGTTA1502006063METAFISHR1ATAGTGGGGT
34、ATCTAATCCCAGMT12SRDNA2TELEO_FACACCGCCCGTCACTCT1005560TELEO_RCTTCCGGTACACTTACCATGMT12SRDNA3TELE02_FAAACTCGTGCCAGCCACC1502005560TELE02_RGGGTATCTAATCCCAGTTTGDB32/T45392023附录B（资料性）常用淡水生物DNA条形码扩增引物信息常用淡水生物DNA条形码扩增引物信息如表B.1所列。表B.1常用淡水生物DNA条形码扩增引物信息12目标群落基因名称引物名称引物序列（53）预期长度BP退火温度鱼类MT12SRDNA4MIFISH_U_FGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC1502005560MIFISH_U_RCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTGMT16SRDNAFISH16S_FGGTCGCCCCAACCRAAG1005560FISH16S_RCGAGAAGACCCTWTGGAGCTTIAGDB32/T45392023表B.1常用淡水生物DNA条形码扩增引物信息（续）（VRHDS（简并碱基代码：M：A/C）、：A/C/G）、：A/G）、：A/C/T）、W：A/T）、：A/G/T）、：C/B（YNK（G）、：C/G/T）、：C/T）、：A/G/C/T）、：G/T）。13DB32/T45392023