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1、ICS65.020.30CCSB4115内蒙古自治区地方标准DB15/T21952021规模化牛场牛病毒性腹泻-黏膜病净化技术规范TechnicalRegulationofEradicationofBovineviraldiarrheainCattleFarms2021-05-25发布2021-06-25实施内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/T21952021前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。本文件起草单位：内蒙古大学、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、内蒙
2、古农业大学、内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研究院、华威特（江苏）生物制药有限公司、赤峰圣泉生态牧业有限公司。本文件主要起草人：王炜、王永杰、徐晓静、赵杰军、程晓飞、贺永强、张福隆、田茂、葛旭升、李庆东、王洪、闫喜军、王潇、李光鹏、胡薇。IDB15/T21952021规模化牛场牛病毒性腹泻-黏膜病净化技术规范1范围本文件规定了规模化牛场牛病毒性腹泻-黏膜病净化的检测方法，无疫场群的建立、维持及综合生物安全措施。本文件适用于规模化牛场牛病毒性腹泻-黏膜病的检测及免疫无疫场的建立。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应
3、的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18637-2018牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范NY/T1168畜禽粪便无害化处理技术规范农医发201725号病死及病害动物无害化处理技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牛病毒性腹泻-黏膜病Bovineviraldiarrhea-mucosaldisease由牛病毒性腹泻病毒引起的牛的传染病。3.2净化Eradication对规模化牛场采取一系列措施，达到清除牛病毒性腹泻-黏膜病的过程。在某一限定的牛场内，根据牛病毒性腹泻病毒的监测结果，
4、及时发现并淘汰持续性感染（Persistentinfection，PI）牛，使规模化牛场中牛病毒性腹泻-黏膜病逐渐被清除的疫病控制方法。4材料与方法4.1仪器PCR仪、凝胶成像系统、高速台式冷冻离心机、组织研磨器或者研钵、普通冰箱、微量移液器、酶标仪、恒温箱、高压灭菌锅。4.2试剂1DB15/T21952021RNA提取试剂盒；反转录酶、聚合酶，-20保存，避免反复冻融；除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯；实验室用水应符合GB/T6682的要求。4.3检测方法4.3.1抗原检测根据情况，选择下列之一或组合方法进行检测。4.3.1.1荧光定量PCR参照GBT18637-2018，6.3荧
5、光RT-PCR检测方法。4.3.1.2RT-PCR检测采用附录ART-PCR检测方法进行检测。4.3.1.3ELISA检测采用商品化抗原捕捉ELISA方法。4.3.2血清学检测参照GB/T18637-2018，6.2病毒中和试验部分或6.4部分BVDV抗体间接ELISA试验方法进行检测。4.3.3合格免疫抗体判定标准4.3.3.1个体免疫抗体合格标准，采用病毒中和试验，参照GB/T18637-2018，6.2病毒中和试验部分或6.4部分BVDV抗体间接ELISA试验方法进行检测。血清BVDV效价不低于1:256。4.3.3.2群体免疫抗体合格标准，抗体效价不低于1:256的群体阳性率不低于90
6、%。5净化群的建立5.1净化策略5.1.1采用BVDV疫苗免疫结合检测、淘汰持续性感染牛的净化策略。5.1.2做好引种监测，引进的牛应为抗原抗体阴性。5.1.3综合生物安全措施保障到位。5.2感染状况普查阶段5.2.1采样方法5.2.1.1采血颈静脉或尾根分别采集抗凝血和促凝血，集中采集，每样不少于5mL，标记清晰。抗凝血用于抗原检测；促凝血分离血清用于抗体检测。送检时需提供样品清单，包括样品供体的日龄、编号、免疫情况、临床健康状况等。用猪耳断屑器从每头牛的耳廊腹部采取三角形的皮肤活组织样品，大小约为125mm2，然后用裹有医用纱布的回形针压在取样部位止血。2DB15/T219520215.2
7、.2采样数量首次全群采样普查。之后新生犊牛、1月龄犊牛全部采样，免疫牛按5%10%抽样比例采样。5.2.3净化方案5.2.3.1群体血清样品抗体阳性率不超过20%，采用全群普查筛查、淘汰PI牛的策略。18月龄以下牛定期进行抗原、抗体监测，评估BVDV感染风险。新生犊牛用商品化ELISA法或PCR法进行抗原检测，淘汰PI牛。5.2.3.2群体血清样品抗体阳性率超过20%，全群普查筛查、淘汰PI牛，并进行全群免疫接种、监测。5.3免疫间断5.3.1疫苗商品化灭活疫苗或亚单位疫苗。5.3.2免疫程序根据疫苗免疫后抗体监测情况确定免疫程序。可以参考如下免疫程序：群体抗体阳性率20%的牛场，进行春秋两季
8、普免；34月龄犊牛免疫；青年母牛在配种前68周首免，配种前24周进行二免，以后每年在配种前24周免疫1次。5.3.3检测评估二免后28日检测抗体。如果90%的样品抗体不低于1:256，即可认为群体免疫合格。5.4检测与淘汰阶5.4.1首次检测5.4.1.1疫苗二免后28日，采用ELISA方法逐个检验，了解全群BVDV免疫状况，结合ELISA或PCR法检测疑似PI牛。对检测的抗原、抗体均为阴性的牛隔离饲养，以备复检。5.4.1.2对步骤5.4.1.1报告的抗原抗体阴性牛只复查，采用ELISA或PCR法检测抗原，与步骤5.4.1.1间隔时间35周，确保潜在PI牛不遗漏，淘汰复检抗原阳性的牛。5.4
9、.2定期检测5.4.2.1新生犊牛，逐个检验，采集耳朵皮肤组织用ELISA方法或RT-PCR检测抗原，抗原阳性者淘汰。5.4.2.21月龄犊牛，按照上述方法复检，逐个检验，淘汰抗原阳性牛。5.4.2.3疫苗免疫后30日左右，按5%10%抽查抗体，每年二次，常规检验。5.5净化场的评估阶段5.5.1评估时间在进入“假定健康阶段”后，按照免疫无疫标准、净化标准进行净化场评估。5.5.2免疫无疫标准3DB15/T219520215.5.2.1免疫后每年检测1次，抗体阳性率不低于90%。5.5.2.2每年随机按5%10%抽检一次，ELISA抗原初筛和3周后复检，确保连续两年以上无PI牛。5.5.3净化
10、标准5.5.3.1BVDVPCR或ELISA抗原检测阴性。5.5.3.2停止免疫两年以上，无牛病毒性腹泻-黏膜病抗原阳性牛。6净化场的维持阶段6.1免疫制定并实施合理的免疫程序。6.2监测6.2.1每年随机按5%10%抽检一次，抗体不低于1:256，群体阳性率不低于90%。6.2.2出生犊牛抗原检测阴性。6.2.3严格检疫引进牛只，逐头检测，确保抗原阴性。6.2.4建立专门隔离饲养舍，引进后隔离饲养45日以上经检测合格后才可混群饲养。7综合生物安全措施7.1合理的牛场选址根据国家和内蒙古自治区动物防疫合格证有关条件要求进行。7.2生产模式坚持自繁自养，如必须从场外引进，做好隔离检疫。7.3饲养
11、管理加强饲养管理，减少应激。做好通风、保温、适宜的饲养密度。7.4消毒措施严格做好人员、物品、用具、车辆、内外环境以及粪便排泄物和污水的消毒。定期进行消毒，在出入口设置消毒池。7.5无害化处理措施7.5.1粪便处理按NY/T1168的规定执行。7.5.2病死畜无害化处理按农业农村部发布的病死及病害动物无害化处理技术规范执行。7.6有害生物防治措施禁止在场内饲养犬、猫等其它易感动物。每6个月至少开展1次全方位彻底灭鼠。定期杀虫、防蝇。4DB15/T219520217.7其他生物安全措施7.7.1设立隔离区和隔离屏障。7.7.2严禁抗原阳性牛的引入。7.7.3病牛隔离区设于牛舍的下风口。7.8档案
12、管理7.8.1做好生产记录、饲料和饲料添加剂购进和使用记录、兽药购进和使用记录、免疫记录、消毒记录、病死牛无害化处理记录、防疫监测记录、疾病诊疗记录、运输车辆记录、粪便及污物无害化处理记录、人员车辆物品出入登记记录和销售记录等。7.8.2记录保存不少于2年。5反应液组分体积cDNA1.0L10PCR缓冲液5.0L2.5mmol/LdNTP3.0L20pmol/L上游引物0.5L20pmol/L下游引物0.5LDNA聚合酶0.5LDEPC处理水39.5L总体积50.0L反应液组分体积dNTP（2.5mmol/L）5.0L5反转录缓冲液5.0LRNA酶抑制剂1.0LM-MLV反转录酶1.0LDEP
13、C处理水2.0L总体积14.0L引物名称引物序列扩增长度/bpBVDVF5-CATGCCCATAGTAGGAC-3288BVDVR5-CCATGTGCCATGTACAG-3DB15/T21952021附录A（规范性）BVDVRT-PCR检测方法A.1引物序列BVDV病毒核酸RT-PCR检测方法所用引物序列见表A.1。表A.1引物序列A.2RT-PCR提取RNA，取每份样品的RNA5.0L，置0.2mL灭菌离心管中，加入下游引物1.0L，混匀，70作用5分钟，取出，冰浴23分钟。然后加入下列反转录体系。反转录反应条件：混匀后置于42作用1小时，70作用10分钟。反转录获得的cDNA用于PCR扩增或置15以下保存备用。BVDV病毒核酸反转录反应液配方见表A.2。RT-PCR反应液配方见表A.3。RT-PCR反应参数见表A.4。表A.2反转录反应液配方表A.3RT-PCR反应液配方6预变形扩增循环数延伸95，1min94，30s；53-58，30s；72，1min3072，10minDB15/T21952021表A.4RT-PCR反应参数7