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1、植物生理学模块实验指导 李玲 主编 科学出版社 一、维生素 C含量的测定方法（分光光度计法）【实验目的】学习利用分光光度计法测定维生素C（抗坏血酸）含量的原理和方法。【实验原理】维生素 C（抗坏血酸）具有较强的还原力，可以把铁离子（Fe3+）还原成亚铁离子（Fe2+），亚铁离子与红菲啰啉（4,7-二苯基-1,10-菲啰啉，BP）反应形成红色螯合物。此化合物在波长 534nm 处具有强的吸收峰，且吸光度与反应液中抗坏血酸含量呈正相关。因此，可用比色法来测定抗坏血酸含量。【器材与试剂】1.实验仪器与用具 离心机、分光光度计、研钵、电子天平、容量瓶（50ml 和 100ml）、漏斗、滤纸、离 心管、
2、试管。2.实验试剂 50g/L 三氯乙酸（TCA）溶液：称取 5g 三氯乙酸（分析纯），用蒸馏水溶解，稀释至100ml。%磷酸-乙醇溶液：量取 85%磷酸溶液加入到无水乙醇中，并用无水乙醇稀释至 100ml。5g/L BP-乙醇溶液：称取 BP（纯度97%）加入到无水乙醇中溶解，并用无水乙醇稀释至50ml。L FeCl3-乙醇溶液：称取 FeCl3加入到 100ml 无水乙醇中，摇匀。100g/ml 标准抗坏血酸溶液：称取 10mg 抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用），用 50g/L TCA 溶液溶解，定容至 100ml，即 1ml 溶液含 100g 抗坏血酸。现用现配，保存于棕色瓶中
3、，低温冷藏。3.实验材料 苹果、梨、香蕉、柑橘等果实。【实验步骤】1.制作标准曲线 取 7 支试管，编号，按表 1 加入各种溶液，将混合液置于 30反应 60min，然后以 0 号试管混合液为参照，于波长 534nm 处测定吸光度值。以抗坏血酸质量为横坐标，吸光度为纵坐标汇至标准曲线，求的回归方程。表 1 制作抗坏血酸标准曲线试剂含量 项目 试管号 0 1 2 3 4 5 6 抗坏血酸标准液/ml 0 50g/L TCA/ml 无水乙醇/ml 混匀、摇匀%磷酸-乙醇溶液/ml 5g/L BP-乙醇溶液/ml L FeCl3-乙醇溶液/ml 相当于抗坏血酸量/g 0 10 20 30 40 50
4、 60 2.提取 洗净新鲜果实，吸干，剪碎后混匀，分别称取 5g 样品置于研钵中，加入 20ml 50g/L TCA溶液，在冰浴条件下研磨成浆状，转入到 100ml 容量瓶中，并用 50g/L TCA 溶液定容至刻度，混合、提取 10min 后，过滤收集滤液备用。3.测定 计法测定维生素抗坏血酸含量的原理和方法实验原理维生素抗坏血酸具有较强的还原力可以把铁离子还原成亚铁离子亚铁离子与红菲啰啉二苯基菲啰啉反应形成红色螯合物此化合物在波长处具有强的吸收峰且吸光度与反应液中抗坏平容量瓶和漏斗滤纸离心管试管实验试剂三氯乙酸溶液称取三氯乙酸分析纯用蒸馏水溶解稀释至磷酸乙溶液量取磷酸溶液加入到无水乙中并用
5、无水乙稀释至乙溶液称取纯度加入到无水乙中溶解并用无水乙稀释至乙溶液称取加入到无现用现配保存于棕色瓶中低温冷藏实验材料苹果梨香蕉柑橘等果实实验步骤制作标准曲线取支试管编号按表加入各种溶液将混合液置于反应然后以号试管混合液为参照于波长处测定吸光度值以抗坏血酸质量为横坐标吸光度为纵坐标取 1ml 样品提取液于试管中，加入 1ml 50g/L TCA溶液，再按制作标准曲线想通的方法，加入其他成分，进行反应、测定。记录反应体系在波长 534nm处吸光度。重复3 次。【实验作业】计算不同果实维生素C含量。根据吸光度值，在标准曲线上查出响应的混合液中抗坏血酸质量，按下式计算植物组织中抗坏血酸含量。植物组织中
6、抗坏血酸含量以100g 样品（鲜重）中含有的抗坏血酸的质量表示，即 mg/100g。抗坏血酸含量=100（mg/100g）式中，m为由标准曲线求得的抗坏血酸的质量（g）；Vs 为滴定时所用样品中提取液体积（ml）；V为样品提取液总体积（ml）；M为样品质量（g）。【实验扩展】利用此法还可以测定植物组织中脱氢抗坏血酸和总抗坏血酸的含量。测定原理：利用二流苏糖醇（DTT）将脱氢抗坏血酸还原成还原型的抗坏血酸，这样可以通过测定抗坏血酸的含量对脱氢抗坏血酸进行定量分析。测定方法：取 1 ml样品中提取液，加入 60mmol/L DTT 乙酸溶液，再用 Na2HPO4-NaOH溶液调 p-H至 78，置
7、于室温下 10min，使脱氢抗坏血酸还原。然后加入 ml 三氯乙酸溶液，调节平 H至 12.按测定抗坏血酸相同的方法进行测定，计算出总抗坏血酸含量，从中减去样品中原有的还原型抗坏血酸含量，即得脱氢抗坏血酸含量。Vm VsM 1000 计法测定维生素抗坏血酸含量的原理和方法实验原理维生素抗坏血酸具有较强的还原力可以把铁离子还原成亚铁离子亚铁离子与红菲啰啉二苯基菲啰啉反应形成红色螯合物此化合物在波长处具有强的吸收峰且吸光度与反应液中抗坏平容量瓶和漏斗滤纸离心管试管实验试剂三氯乙酸溶液称取三氯乙酸分析纯用蒸馏水溶解稀释至磷酸乙溶液量取磷酸溶液加入到无水乙中并用无水乙稀释至乙溶液称取纯度加入到无水乙中溶解并用无水乙稀释至乙溶液称取加入到无现用现配保存于棕色瓶中低温冷藏实验材料苹果梨香蕉柑橘等果实实验步骤制作标准曲线取支试管编号按表加入各种溶液将混合液置于反应然后以号试管混合液为参照于波长处测定吸光度值以抗坏血酸质量为横坐标吸光度为纵坐标