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1、精心整理 微生物限度检查方法验证方案 1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。3.规范性引用文件：根据中国药典2010 年版二部附录 J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性
2、，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。4.验证实施：4.4.1 试验前的准备:4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径 50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121，灭菌 30 min，在 3 天内使用。4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）
3、等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2 小时内，放于湿热灭菌器中，在121，灭菌 15 min，在 3 周内使用。4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯 80 的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在 121，灭菌 15 min，在 3周内使用。精心整理 4.4.2 试验菌的制备和稀释：4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液：4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌
4、液：4.4 4.4.2.2.2 取上述均匀培养物（菌悬液），用 0.9%无菌氯化钠溶液对倍稀释，制成每 1ml含菌 10100cfu 的试验菌液。4.4 4.4.3 供试液的制备：4.4.3.1 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。4.4.3.2，取供试品养胃舒软胶囊 5g，加至含溶化的（温度不超过 45）5g 司盘 80、3g 单硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯 80 无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃搅拌成团后，慢慢加入 45pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为 1：20 的供试液。4.4 4.4.4.1 验证试验分 4
5、组，照微生物限度检查法操作，分别用 3 个不同批号样品进行 3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照试验组的菌回收率。4.4.4.2试验组：4.4.4.2.1 平皿法：分 1：20 的供试液 1ml 和试验菌液（含菌 50100CFU）1ml，注入同一直径 90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备 2 个平皿。4.4 4.4 酵母菌计数和控制菌检查特制定本验证方案通过比较试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性有效性和重现性以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计所采用的方法适用于该品种的微生物限度检组批准范围本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证规范性引用文件根
6、据中国药典年版二附录微生物限度检查法的要求由于某些供试品具有抗菌活性在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变用具的准备将试验需用的试管刻度吸管薄膜过滤器滤膜孔径直径平皿空三角瓶称量纸等用牛皮纸包扎好后放于湿热灭菌器中在灭菌在天内使用试验用培养基的制备取适用性检查合格的营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基营养肉汤培精心整理 4.4.4.4.1 平皿法：取 1：20 供试液 1ml，注入直径 90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备 2 个平皿。4.4 4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中
7、微生物受影响的程度。4.4 4.4 4.4.4.6倾注培养基：在菌液组各平皿中分别倾注 1520ml 温度不超过 45的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，其中，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌用营养琼脂培养基，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固。4.4.4.7培养观察：用于细菌计数的营养琼脂培养基平板，倒置于 3035的培养箱中，培养 48 小时；用于霉菌、酵母菌计数的玫瑰红钠琼脂培养基平板，倒置于 2328的培养箱中，培养 72 小时。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。4.4.4.8菌落计数：将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背
8、景，仔细观察并记录结果。4.4.4.9计算回收率 100%稀释剂对照组回收率 100%4.4.4.10结果判定：在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于 70。试验组的菌回收率均不低于 70，则照该供试液制备方法和计数法测定。若任一次试验中试验组的菌回收率低于 70，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：第一次：样品名称 试验日期 规格 样品批号 生产商 类别 酵母菌计数和控制菌检查特制定本验证方案通过比较试验菌的恢复生长结果来评价整个检验
9、方法的准确性有效性和重现性以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计所采用的方法适用于该品种的微生物限度检组批准范围本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证规范性引用文件根据中国药典年版二附录微生物限度检查法的要求由于某些供试品具有抗菌活性在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变用具的准备将试验需用的试管刻度吸管薄膜过滤器滤膜孔径直径平皿空三角瓶称量纸等用牛皮纸包扎好后放于湿热灭菌器中在灭菌在天内使用试验用培养基的制备取适用性检查合格的营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基营养肉汤培精心整理 供试液的制备及处理 保温振摇法 研钵法 匀浆仪 档 min 水溶
10、性供试品：供试品 g(ml)，加稀释剂 ml，制成1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量 ml。非水溶性供试品：供试品 g(ml)，加乳化剂（名称 ；批号 ）g(ml)，加稀释剂 ml，制成 1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量 ml。其它：。技术方法 细菌计数 霉菌和酵母菌计数 培养基名称 营养琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 配制批号 培养温度 培养起止时间 菌种名称菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 菌种编号 菌悬液批号 菌液稀释倍数 试验组（cfu）1 2 平均 菌液组（cfu）1 2 平均 稀释剂对照组（cfu）1 2 平均 供
11、试品对照组（cfu）1 2 平均 试验组回收率(%)稀释剂对照组回收(%)结论 检查人/日期 复核人/日期 酵母菌计数和控制菌检查特制定本验证方案通过比较试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性有效性和重现性以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计所采用的方法适用于该品种的微生物限度检组批准范围本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证规范性引用文件根据中国药典年版二附录微生物限度检查法的要求由于某些供试品具有抗菌活性在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变用具的准备将试验需用的试管刻度吸管薄膜过滤器滤膜孔径直径平皿空三角瓶称量纸等用牛皮纸包扎
12、好后放于湿热灭菌器中在灭菌在天内使用试验用培养基的制备取适用性检查合格的营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基营养肉汤培精心整理 第二次：样品名称 试验日期 规格 样品批号 生产商 类别 供试液的制备及处理 保温振摇法 研钵法 匀浆仪 档 min 水溶性供试品：供试品 g(ml)，加稀释剂 ml，制成1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量 ml。非水溶性供试品：供试品 g(ml)，加乳化剂（名称 ；批号 ）g(ml)，加稀释剂 ml，制成 1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量 ml。其它：。技术方法 细菌计数 霉菌和酵母菌计数 培养基名称 营养琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培
13、养基 配制批号 培养温度 培养起止时间 菌种名称菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 菌种编号 菌悬液批号 菌液稀释倍数 试验组（cfu）1 2 平均 菌液组（cfu）1 2 平均 稀释剂对照组（cfu）1 2 平均 供试品对照组（cfu）1 2 平均 酵母菌计数和控制菌检查特制定本验证方案通过比较试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性有效性和重现性以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计所采用的方法适用于该品种的微生物限度检组批准范围本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证规范性引用文件根据中国药典年版二附录微生物限度检查法的要求由于某些供
14、试品具有抗菌活性在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变用具的准备将试验需用的试管刻度吸管薄膜过滤器滤膜孔径直径平皿空三角瓶称量纸等用牛皮纸包扎好后放于湿热灭菌器中在灭菌在天内使用试验用培养基的制备取适用性检查合格的营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基营养肉汤培精心整理 试验组回收率(%)稀释剂对照组回收(%)结论 检查人/日期 复核人/日期 第三次：样品名称 试验日期 规格 样品批号 生产商 类别 供试液的制备及处理 保温振摇法 研钵法 匀浆仪 档 min 水溶性供试品：供试品 g(ml)，加稀释剂 ml，制成1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量 ml
15、。非水溶性供试品：供试品 g(ml)，加乳化剂（名称 ；批号 ）g(ml)，加稀释剂 ml，制成 1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量 ml。其它：。技术方法 细菌计数 霉菌和酵母菌计数 培养基名称 营养琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 配制批号 培养温度 培养起止时间 菌种名称菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 菌种编号 菌悬液批号 菌液稀释倍数 试验组（cfu）1 2 平均 菌液组（cfu）1 2 平均 稀释剂对照组（cfu）1 2 酵母菌计数和控制菌检查特制定本验证方案通过比较试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性有效性和重现性以确认供试
16、品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计所采用的方法适用于该品种的微生物限度检组批准范围本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证规范性引用文件根据中国药典年版二附录微生物限度检查法的要求由于某些供试品具有抗菌活性在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变用具的准备将试验需用的试管刻度吸管薄膜过滤器滤膜孔径直径平皿空三角瓶称量纸等用牛皮纸包扎好后放于湿热灭菌器中在灭菌在天内使用试验用培养基的制备取适用性检查合格的营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基营养肉汤培精心整理 平均 供试品对照组（cfu）1 2 平均 试验组回收率(%)稀释剂对照组回收(%)结论 检查人/日期
17、 复核人/日期 4.4.5 控制菌检查方法验证方法:4.4.5.1 根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌，选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验分 3 组，分别用 3 个不同批号样品或同一批号样品进行 3 次独立的平行试验。4.4.5.2试验组：4.4.5.2.1 平皿法：取 1：10 的供试液 10ml（相当于供试品 1g、1ml、10cm2）和 1ml 试验菌液（含菌 10100CFU）加入同一增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。4.4 4.4.5.3 阳性对照：取 1ml 试验菌液（含菌 10100CFU），加入增菌培养基中，按
18、相应控制菌的检查方法进行检查。4.4.5.4 阴性对照：取 10ml 稀释剂或缓冲液替代供试液，加入增菌培养基中，按相应控制菌的检查方法进行检查。4.4.5.5结果判定：在 3 次独立的平行试验中，阳性对照组应检出试验菌，阴性菌对照组应无菌生长。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，建立新的方法，并重新验证。4.4.5.6控制菌检查方法验证结果：第一次：控制菌名称 样品名称 试验日期 酵母菌计数和控制菌检查特制定本验证方案通过比较试验菌
19、的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性有效性和重现性以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计所采用的方法适用于该品种的微生物限度检组批准范围本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证规范性引用文件根据中国药典年版二附录微生物限度检查法的要求由于某些供试品具有抗菌活性在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变用具的准备将试验需用的试管刻度吸管薄膜过滤器滤膜孔径直径平皿空三角瓶称量纸等用牛皮纸包扎好后放于湿热灭菌器中在灭菌在天内使用试验用培养基的制备取适用性检查合格的营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基营养肉汤培精心整理 规格 样品批号 生产商 类别 供试液
20、的制备及处理 保温振摇法 研钵法 匀浆仪 档 min 水溶性供试品：供试品 g(ml)，加稀释剂 ml，制成1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量 ml。非水溶性供试品：供试品 g(ml)，加乳化剂（名称 ；批号 ）g(ml)，加稀释剂 ml，制成 1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量 ml。其它：。培养基名称 培养时间 培养起止时间 菌落生长情况 试验组 阳性对照 阴性对照 结论 检查人/日期 复核人/日期 第二次：控制菌名称 样品名称 试验日期 规格 样品批号 生产商 类别 供试液的制备及处理 保温振摇法 研钵法 匀浆仪 档 min 水溶性供试品：供试品 g(
21、ml)，加稀释剂 ml，制成1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量 ml。非水溶性供试品：供试品 g(ml)，加乳化剂（名称 ；批号 ）g(ml)，加稀释剂 ml，制成 1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量 ml。其它：。培养基名称 培养时间 培养起止时间 菌落生长情况 试验组 阳性对照 阴性对照 酵母菌计数和控制菌检查特制定本验证方案通过比较试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性有效性和重现性以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计所采用的方法适用于该品种的微生物限度检组批准范围本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证规范性引用文件根据
22、中国药典年版二附录微生物限度检查法的要求由于某些供试品具有抗菌活性在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变用具的准备将试验需用的试管刻度吸管薄膜过滤器滤膜孔径直径平皿空三角瓶称量纸等用牛皮纸包扎好后放于湿热灭菌器中在灭菌在天内使用试验用培养基的制备取适用性检查合格的营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基营养肉汤培精心整理 结论 检查人/日期 复核人/日期 第三次：控制菌名称 样品名称 试验日期 规格 样品批号 生产商 类别 供试液的制备及处理 保温振摇法 研钵法 匀浆仪 档 min 水溶性供试品：供试品 g(ml)，加稀释剂 ml，制成1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数
23、 次，每膜冲洗量 ml。非水溶性供试品：供试品 g(ml)，加乳化剂（名称 ；批号 ）g(ml)，加稀释剂 ml，制成 1：供试液；取供试液 ml，冲洗次数 次，每膜冲洗量 ml。其它：。培养基名称 培养时间 培养起止时间 菌落生长情况 试验组 阳性对照 阴性对照 结论 检查人/日期 复核人/日期 4.4.6 验证结论:根据上述验证结果,总结出该品种的微生物限度检查方法如下:5.验证结果评价与建议你 5.1 验证结果评估与结论：按照验证方案的要求实施验证，并将验证过程记录在验证报告中。对微生物限度检查方法验证的数据进行分析，对验证的结果进行分析和评价，并建议日常监控的项目和周期。5.2 验证会
24、审 酵母菌计数和控制菌检查特制定本验证方案通过比较试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性有效性和重现性以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计所采用的方法适用于该品种的微生物限度检组批准范围本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证规范性引用文件根据中国药典年版二附录微生物限度检查法的要求由于某些供试品具有抗菌活性在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变用具的准备将试验需用的试管刻度吸管薄膜过滤器滤膜孔径直径平皿空三角瓶称量纸等用牛皮纸包扎好后放于湿热灭菌器中在灭菌在天内使用试验用培养基的制备取适用性检查合格的营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基
25、营养肉汤培精心整理 验证领导小组对验证实施的过程及结果进行分析和评价，做出确认结论。主要关注如下问题是否得到证明和解决：5.2.1 验证过程是否有遗漏？5.2.2 验证过程中对验证方案是否进行过修改？修改原因、依据是否充分？是否经批准？5.2.3 验证记录是否完整？数据是否真实？5.2.4 验证结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明是否合理？是否需要做进一步实验？5.4 最终批准：本验证项目按照验证方案的步骤和要求实施验证后，由验证小组对验证的结果进行分析和评价，验证领导小组组长在验证小组分析和评价的基础上，批准验证是否合格，批准是否投入检验使用。酵母菌计数和控制菌检查特制定本验证方案通过比较试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性有效性和重现性以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计所采用的方法适用于该品种的微生物限度检组批准范围本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证规范性引用文件根据中国药典年版二附录微生物限度检查法的要求由于某些供试品具有抗菌活性在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变用具的准备将试验需用的试管刻度吸管薄膜过滤器滤膜孔径直径平皿空三角瓶称量纸等用牛皮纸包扎好后放于湿热灭菌器中在灭菌在天内使用试验用培养基的制备取适用性检查合格的营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基营养肉汤培