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1、实验考马斯亮蓝法测定 蛋白质含量实验五考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 一、实验目的 1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法 2.熟练分光光度计的使用和操作方法。二、实验原理 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋口质的疏水微区相结合，这 种结合具有高敬感性。它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm,当它与蛋白质结合形 成复合物时，其最大吸收峰改变为595nn)o考马斯亮蓝G-250蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围 内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝结合 法是近年来发展起来的蛋口质定量测定法，本方法具有操作
2、方便、快速、干扰因素少的特点。离心机的使用说明：1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。2.离心 管的放置是对角线放置，要求必须对称。3.先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定 好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。分光光度计的使用说明：1接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。2.放 入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿(溶液装入4/5高度，置第一格)置于光路上，调节100%透射比按钮，使吸光度值A二0.00。3.推动试样架拉手，使样 品比色皿置于光路上，读出吸光度值。4.测量完毕，取出比色肌，洗净后置于
3、乙醇溶液中浸泡脱 色。5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。三、试剂与器材：1.试剂：(1)0.9%NaCl：9gNaCl 解在 1L 的容量瓶中。(2)标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。(3)染液：考马斯亮蓝G-2500.5g,溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85%(W/V)磷酸，保存于 棕色瓶中，称为母液。取150mL然后加蒸係水定容到lOOOmL,保存于棕色瓶中，备用。2.器材：试管；吸管10mL、15mL、ImL、0.ImL；722分光光度计 定蛋白质含量的原理与方法熟练分光光度计的使用和操作方法二实验原理考马斯亮蓝测定蛋白质含量属于染料结合法的一
4、种它与蛋口质的疏水微区相结合这种结合具有高敬感性它在酸性溶液中呈棕红色最大光吸收峰在当它与蛋白质性关系故可以用于蛋白质含量的测定考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋口质定量测定法本方法具有操作方便快速干扰因素少的特点离心机的使用说明要离心的离心管和管套要称重重量不时将水加在管套里离心管的放置是对角提速到预定转速分光光度计的使用说明接通电源开关预热后再选择须用的单色光波长放入已加入溶液的比色皿盖上样品室盖推动试样架拉手使对照比色皿溶液装入高度置第一格置于光路上调节透射比按钮使吸光度值二推动试样架拉四、操作方法 1.标准曲线的制备 取6支试管，按下表加入各：定蛋白质含量的原理与方法熟练分光光度计的
5、使用和操作方法二实验原理考马斯亮蓝测定蛋白质含量属于染料结合法的一种它与蛋口质的疏水微区相结合这种结合具有高敬感性它在酸性溶液中呈棕红色最大光吸收峰在当它与蛋白质性关系故可以用于蛋白质含量的测定考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋口质定量测定法本方法具有操作方便快速干扰因素少的特点离心机的使用说明要离心的离心管和管套要称重重量不时将水加在管套里离心管的放置是对角提速到预定转速分光光度计的使用说明接通电源开关预热后再选择须用的单色光波长放入已加入溶液的比色皿盖上样品室盖推动试样架拉手使对照比色皿溶液装入高度置第一格置于光路上调节透射比按钮使吸光度值二推动试样架拉 以各管相 质含量 坐标、坐标，绘
6、 线。2.待测样 中加蛋口 1.OmL,再 考马斯亮 剂，摇 5min 后，长下吸光 A595o 根 A595从标 得蛋口质 管号 0 1 2 3 4 5 标准蛋 白溶液(ml)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.9%XaC 1溶液(ml)1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 待测样 品(ml)/考马斯 亮蓝试 剂(ml)5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 摇匀，放置5min,测吸光度值 A595nm 应标准蛋口(mg)为横 A595为纵 制标准曲 品测定 质样品 加入5.OmL 蓝G-250试 匀，放置 在595nm波 度值，记录 据所测 准曲线上查 含量。并计
7、 算蛋口样品的浓度(mg/ml)o 五、实验结果及分析 六、思考J 蛋口质含量的测定还有哪些方法其优缺点是什么 定蛋白质含量的原理与方法熟练分光光度计的使用和操作方法二实验原理考马斯亮蓝测定蛋白质含量属于染料结合法的一种它与蛋口质的疏水微区相结合这种结合具有高敬感性它在酸性溶液中呈棕红色最大光吸收峰在当它与蛋白质性关系故可以用于蛋白质含量的测定考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋口质定量测定法本方法具有操作方便快速干扰因素少的特点离心机的使用说明要离心的离心管和管套要称重重量不时将水加在管套里离心管的放置是对角提速到预定转速分光光度计的使用说明接通电源开关预热后再选择须用的单色光波长放入已加入溶液的比色皿盖上样品室盖推动试样架拉手使对照比色皿溶液装入高度置第一格置于光路上调节透射比按钮使吸光度值二推动试样架拉