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1、大肠杆菌利用甘油生产 C4-二羧酸类物质的代谢工程研究 甘油作为生物柴油产业的主要副产物,日益成为一种廉价、可持续的生物发 酵工业的原料和底物。C4-二羧酸类物质（琥珀酸、富马酸和苹果酸）在食品、制 药、化工等领域都有非常广泛的应用。本文通过代谢工程和进化工程的策略构建了能够利用甘油为底物高效生产 C4-二羧酸类物质的大肠杆菌菌株。首先利用基元模式分析的方法对大肠杆菌在 好氧、微氧和厌氧条件下利用甘油为底物生产琥珀酸的代谢网络模型分别进行了 系统的计算和分析。根据基元模式分析的结果,构建了好氧琥珀酸生产菌株,琥珀酸的得率达到 0.22 mol/mol甘油，但副产物a-酮戊二酸会大量积累。通过对
2、敲除磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶的菌株进行适应性进化，提高了乙醛酸循环的通量，进而使得a-酮 戊二酸的产量降低了 46%,琥珀酸的得率提高了 30%。通过过表达 a-酮戊二酸脱氢酶,进一步大大降低了 a-酮戊二酸的产量,并 将琥珀酸的得率提高了 20%,达到了好氧发酵最大理论得率的 67%。此外,异柠檬 酸脱氢酶的编码基因 icdA 的编码区在进化过程中发生了错义突变 G583T。通过将该突变引入对照菌株,大大提高了琥珀酸的得率,说明该突变是造成 乙醛酸循环通量提高的主要原因。通过进化工程和代谢工程策略构建的菌株 E2-sdh-ppc-sucAB 在 1L 的发酵罐中通过补料分批发酵,能够消耗 1
3、20 g/L 甘油产 生43.2 g/L 琥珀酸。以构建的好氧条件下的琥珀酸高产菌株为基础,通过敲除三个富马酸酶,成 功地使大肠杆菌能够利用甘油为底物生产富马酸,但会大量积累副产物乙酸。为 了降低副产物乙酸的积累,尝试了多种代谢工程方法。其中通过过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或乙醛酸循环操纵子来提高回补 途径的通量,能有效的降低乙酸和提高富马酸的产量。在 1L 的发酵罐中通过补料 分批发酵方式,菌株 EF02(pSCppc共消耗了 94 g/L 甘油,产生了 41.5 g/L 富马 酸,富马酸的得率达到最大理论得率的 70%。基于基元模式分析,构建了大肠杆菌在微氧条件下利用甘油生产琥珀酸的菌 株
4、,并在此基础上通过进一步的代谢工程策略构建了利用甘油生产苹果酸的菌株 并研究了多个途径对苹果酸生产的影响。最终菌株在微氧条件下的琥珀酸产量和 得率分别达到 11.5 g/L 和 0.64 mol/mol 甘油。苹果酸生产菌株的苹果酸产量和得率分别达到 7.5 g/L 和 0.57 mol/mol 甘 油。续的生物发酵工业的原料和底物二羧酸类物质琥珀酸富马酸和苹果酸在食品制药化工等领域都有非常广泛的应用本文通过代谢工程和进化工程的策略构建了能够利用甘油为底物高效生产二羧酸类物质的大肠杆菌菌株首先利用基元模计算和分析根据基元模式分析的结果构建了好氧琥珀酸生产菌株琥珀酸的得率达到甘油但副产物酮戊二酸会大量累通过对敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的菌株进行适应性进化提高了乙醛酸循环的通量进而使得酮戊二酸的产量降低了了好氧发酵最大理论得率的此外异柠檬酸脱氢酶的编码基因的编码区在进化过程中发生了错义突变通过将该突变引入对照菌株大大提高了琥珀酸的得率说明该突变是造成乙醛酸循环通量提高的主要原因通过进化工程和代谢工程策略