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1、牛奶中部分成分的分析 一、实验目的（1）学习利用等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白（2）掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法（3）熟悉可见光分光光度计的操作（4）加强对沉淀、抽滤、溶液配制等基本操作的锻炼（5）分析牛奶中蛋白质与钙的含量。（6）掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法（7）通过与牛奶包装上注明的含量比较，对实验分析结果进行客观评价 二、实验原理 牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为 35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为。利用等电点时溶解度最低的原理，加入醋酸将牛乳的 pH 调至时，使酪蛋白沉淀 出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质，抽滤、纯化后便可得到纯酪蛋白
2、。双缩脲（NH2C0NHC0NM）在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反 应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与 CiF+反应产生紫红色化合物。在一定范 围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲 法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但 灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-C0NH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也 有此反应。钙与身体健康息息相关，钙除成骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的 主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青
3、少年发育迟缓，孕妇 高血压，老年人的骨质疏松症。缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性 疾病。补钙越来越被人们所重视。牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加 钙而成为钙奶。对于液体牛奶中钙的含量，可采用 EDTA 法进行直接测定。考虑到牛奶中含有 F3+、Al3+等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节 pH-1213,以铬蓝黑 R 作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用 EDTA 滴定至计量点时，游离出指示剂，溶液呈现蓝色。三、材料、试剂与仪器（一）材料 新鲜牛奶、加钙牛奶（二）试剂 95%乙醇、无水乙醚、醋酸、醋酸钠、NaOH、CuS（4 5 缶 0
4、、酒石酸钾、碘化钾、牛血清 蛋白（BSA）、EDTA 基准物质 CaCQ、HCI、三乙醇胺、铬蓝黑 R、盐酸羟胺、邻二氮菲（邻 菲啰啉）、浓硝酸、硫代硫酸钠、甲基红、氨水 1、mol L1醋酸-醋酸钠缓冲液 先配 A 液与 B 液。A 液：L 醋酸钠溶液。B 液：L 醋酸溶液。取醋酸钠固体 1.64g 加水溶解并稀释至 100ml，取冰醋酸加水稀释至 120ml，取 A液，B 液，混合即得的醋酸一一醋酸钠缓冲液 200mL。2、乙醇一乙醚混合液：乙醇：乙醚=1:1（V/V）3、NaOH（6molL-1）：称取 12g 氢氧化钠溶于 50mL 水中。4、双缩脲试剂：称取 CuS0 5H2O 3.
5、0g，酒石酸钾 9.0 g 和碘化钾 5.0g，分别溶解后混匀，加 6 mol L-1NaOH lOOmL,最后加水至 1000mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。5、NaCl 6、蛋白质标准液（10mgmL-1）,用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白，以少量生理盐水溶解后倒 入 l0mL 容量瓶中,淋洗小烧杯数次,一并倒入容量瓶中,最后加生理盐水至刻度线。7、待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的 酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。（如若不能溶解,滴加几滴 6mol/L NaOH 溶液、分别用 l0mL 容量瓶定容）&EDTAU1）:称取 2.
6、0g EDTA 二钠盐，用温热水溶解后，稀释至 500mL，储存于聚乙烯塑料 瓶中。方法熟悉可见光分光光度计的操作加强对沉淀抽滤溶液配制等基本操作的锻炼分析牛奶中蛋白质与钙的含量掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法通过与牛奶包装上注明的含量比较对实验分析结果进行客观评价二实验低的原理加入醋酸将牛乳的调至时使酪蛋白沉淀出来用乙醇洗涤沉淀物除去脂类杂质抽滤纯后便可得到纯酪蛋白双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色合物称为双缩脲反应蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与反应测定蛋白质浓度的常用方法之一操作简便迅速受蛋白质种类性质的影响较小但灵敏度较差而且特异性不高除有此反应外等基团也
7、有此反应钙与身体健康息息相关钙除成骨以支撑身体外还参与人体的代谢活动它是细胞的主要阳离子还得率 提取得到的含量 真实含量 温度计 四、操作步骤（一）牛奶中酪蛋白的提取 1、酪蛋白的粗提 50mL 鲜牛奶加热至 40 C。在搅拌下慢慢加入预热至 pH试纸或酸度计调 pH 至。将上述悬浮液冷却至室温。离心 15 分钟（3000 r min-1）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。2、酪蛋白的纯化 用水洗涤沉淀 3 次，离心 10 分钟（3000r min-1）,弃去上清液。在沉淀中加入 30mL 乙 醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇 一乙醚混合液洗沉淀 2 次。最 后用乙醚洗沉淀 2
8、 次，抽干。将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯品。3、准确称重，计算含量和得率 含量：酪蛋白 g/（100 mL）牛乳 9、CaCO 标准溶液 mol 匸1）：准确称取基准物质 CaCQO.Ig左右，先以少量水润湿，再逐滴 小心加入 6 mol L-1HCl,至 CaCO 完全溶解，定量转入 100mL 容量瓶中,以水稀释至刻度,并计算其浓度。10、NaOH(5 mol L-1)11、HCl(6 mol L-1)12、三乙醇胺（200g L：1）13、铬蓝黑 R（5 gL1）乙醇溶液（三）仪器 试管、移液管（1mL、5mL、20 mL）、l0mL 容量瓶、烧杯、表面皿、250mL 锥形瓶、
9、1000mL 棕色试剂瓶、25mL 具塞比色管、试管架、坩埚、60mL 分液漏斗 水浴箱、可见光分光光度计、离心机、抽滤装置、精密 pH 试纸（可测）,酸度计、电炉、40 C、的醋酸缓冲液 50mL 用精密 方法熟悉可见光分光光度计的操作加强对沉淀抽滤溶液配制等基本操作的锻炼分析牛奶中蛋白质与钙的含量掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法通过与牛奶包装上注明的含量比较对实验分析结果进行客观评价二实验低的原理加入醋酸将牛乳的调至时使酪蛋白沉淀出来用乙醇洗涤沉淀物除去脂类杂质抽滤纯后便可得到纯酪蛋白双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色合物称为双缩脲反应蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液
10、中也能与反应测定蛋白质浓度的常用方法之一操作简便迅速受蛋白质种类性质的影响较小但灵敏度较差而且特异性不高除有此反应外等基团也有此反应钙与身体健康息息相关钙除成骨以支撑身体外还参与人体的代谢活动它是细胞的主要阳离子还（二）酪蛋白含量的测定 1、标准曲线的绘制与样品的测定 取试管 8 支，按下表操作。1 2 3 4 5 6 测定管 1 测定管 2 蛋白质标准液（mL）一 一 一 待测蛋白样品（mL）一 一 一 一 一 一%NaCI(mL)-一 一 双缩脲试剂（mL）吸光度 A 各管混匀、放置 37C水浴中保温 20min。540nm 比色，以空白管调零点，读取各管吸光 度值。2、计算 在电脑上以吸
11、光度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。从标准曲线中查 出待测样本的蛋白质浓度（g/L）,并求出牛奶中蛋白质浓度。由此浓度计算出 100mL 鲜牛奶 中酪蛋白的真实含量。（三）钙含量的测定 1、EDTA 溶液浓度的标定 准确移取 CaCO 标准溶液 3 份分别于 250mL 锥形瓶中，加入 2mL NaOH 溶液，铬蓝黑 R 指示剂34 滴，用 EDTA 溶液滴定至溶液由红色变为蓝色即为终点，根据滴定用去 EDTA 毫升数和 CaCQ 标准溶液的浓度，计算 EDTA 溶液的浓度。2、钙制剂钙含量的测定 准确移取一定量的鲜牛奶和钙奶，分别转移到 100mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，摇
12、 方法熟悉可见光分光光度计的操作加强对沉淀抽滤溶液配制等基本操作的锻炼分析牛奶中蛋白质与钙的含量掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法通过与牛奶包装上注明的含量比较对实验分析结果进行客观评价二实验低的原理加入醋酸将牛乳的调至时使酪蛋白沉淀出来用乙醇洗涤沉淀物除去脂类杂质抽滤纯后便可得到纯酪蛋白双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色合物称为双缩脲反应蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与反应测定蛋白质浓度的常用方法之一操作简便迅速受蛋白质种类性质的影响较小但灵敏度较差而且特异性不高除有此反应外等基团也有此反应钙与身体健康息息相关钙除成骨以支撑身体外还参与人体的代谢活动它是细胞的主要
13、阳离子还匀。准确移取上述试液，加入三乙醇胺溶液 5mL,5molL-1NaOH 4mL,加入水 20mL，摇匀,加铬蓝黑 R34 滴，用 L-1EDTA 标准溶液滴定，接近终点时再补加 23 滴铬蓝黑 R,当溶液 由红色变为蓝色即为终点，根据消耗 EDTA 的体积，计算出鲜奶和钙奶中钙的含量(g/100 mL)，并与包装上注明的含量作比较。3、注意事项 量取鲜奶和钙奶的量视钙含量多少而确定，以消耗 mol L-1EDTA 体积为 2030 mL。牛奶、由于钙奶均为乳白色，终点颜色变化不太明显，接近终点时再补加 23 滴指示剂。思考题 1、了解蛋白质及钙、铁、锌等微量元素与人体健康的关系 3、本
14、实验中哪些物质质量需要准确称量，哪些溶液体积需要准确量取 4、除本实验选用的方法外，测定蛋白质与钙还有那些方法 方法熟悉可见光分光光度计的操作加强对沉淀抽滤溶液配制等基本操作的锻炼分析牛奶中蛋白质与钙的含量掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法通过与牛奶包装上注明的含量比较对实验分析结果进行客观评价二实验低的原理加入醋酸将牛乳的调至时使酪蛋白沉淀出来用乙醇洗涤沉淀物除去脂类杂质抽滤纯后便可得到纯酪蛋白双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色合物称为双缩脲反应蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与反应测定蛋白质浓度的常用方法之一操作简便迅速受蛋白质种类性质的影响较小但灵敏度较差而且特异性不高除有此反应外等基团也有此反应钙与身体健康息息相关钙除成骨以支撑身体外还参与人体的代谢活动它是细胞的主要阳离子还