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1、专题 1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在 DNA 分子水平上进行设计和施工的，又叫做 DNA 重组技术。操作水平：分子 原理：基因重组（一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链 DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两
2、种形式：黏性末端和平末端。2.“分子缝合针”DNA 连接酶(1)两种 DNA 连接酶（EcoliDNA 连接酶和 T4-DNA 连接酶）的比较：相同点：都缝合磷酸二酯键。区别：EcoliDNA 连接酶来源于 T4噬菌体，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而 T4DNA 连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。(2)与 DNA 聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA 连接酶是连接两个 DNA 片段的末端，形成磷酸二酯键。3.“分子运输车”载体（1）载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有
3、一至多个限制酶切点，供外源 DNA 片段插入。具有标记基因，供重组 DNA 的鉴定和选择。（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状 DNA 分子。（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 一基因的结构：基因是有遗传效应的DNA 片段(注：RNA 病毒为 RNA)，分为编码区和非编码区。编码区：能转录出 mRNA，原核生物中也就是能编码蛋白质的区段 非编码区：不能转录出 mRNA，也不能编码蛋白质的区段（）原核细胞基因的结构 非编码区中存在调控遗传信息表达的核苷酸序列:编码区上游的 RNA 聚合酶结合
4、位点，即启动子，可控制 RNA 聚合酶的结合。RNA 聚合酶是一种蛋白质，能识别并结合调控序列中的结合位点，能催化 DNA 转录为 RNA 编码区下游有终止子，可控制 RNA 聚合酶的停止、脱落。（2）真核细胞基因的结构 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。技术扩增目的基因（1）原理：DNA 双链复制（2）过程：第一步：加热至 9095DNA 解链；第二步：冷却到 5560，引物结合到互补 DNA 链；第三步：加热至 7075，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补
5、链的合成。(3)前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物。(4)条件：a.四种脱氧核苷酸 的两条链为模板 c.热稳定 DNA 聚合酶(Taq 酶）d.一对引物（一小段单链 DNA 或 RNA，一般 2030个碱基，能与 DNA 母链的一段碱基序列互补配对）e.温度控制和缓冲液 4.从基因文库中获取目的基因：基本概念的理解：将含有某种生物不同基因的许多 DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。将某种生物体内的 DNA 全部提取出来，选用适当的限制酶，将 DNA 切成一定范围大小的DNA 片段，然后将这些片段分别与载体连接起来，导入
6、受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的 DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因。这种基因文库叫基因组文库。有些基因文库比较小，只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，如 cDNA 文库（用某种生物发育的某个时期的 mRNA 反转录产生的多种互补 DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体叫做这种生物 cDNA 文库。）怎样提取：根据目的基因有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列，基因的功能，基因在染色体的位置，基因的转录产物 mRNA 以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。5.人工合成:反转录法：以目的基因转录成的信使
7、 RNA 为模板，反转录成互补的单链 DNA，然后在酶的作用下合成双链 DNA，从而获得所需的基因。目的基因转录成的 mRNA 单链 DNA 双链 DNA（目的基因）根据已知的氨基酸序列合成 DNA 法:蛋白质中氨基酸的序列 mRNA 中的碱基序列 DNA 碱基序列目的基因目的基因 第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成：目的基因启动子终止子标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的首端，是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出 mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）
8、终止子：也是一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的尾端。以新的遗传特性创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品基因工程是在分子水平上进行设计和施工的又叫做重组技术操作水平分子原理基因重组一基因工程的基本工具连接酶的比较分子手术刀限制性核酸内切酶限制酶来源的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开因此具有专一性结果经限制酶切割产生的片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端分子缝合针连接酶两种连接酶连接酶和相同点缝合磷酸二酯键区别连接酶来源于噬菌体只能将双链片段互补的同聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端形成磷酸二酯键连接酶是连接两个片段的末端形成磷酸二酯键分子运输车载体载体具备的条件能在
9、受体细胞中复制并稳定保存具有一至多个限制酶切点供外源片段插入具有标（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步：将目的基因导入受体细胞_ 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用
10、的原核细胞是 大肠杆菌，其转化方法是：先用 Ca2+处理细胞，使其成为 感受态细胞，再将 重组表达载体 DNA 分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA 分子，完成转化过程。3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。第四步：目的基因的检测和表达 1.首先要检测 转基因生物的染色体 DNA 上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。2.其次还要检测 目的基因是否转录出了 mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与 mRNA 杂交。3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用
11、相应的 抗体进行抗原抗体杂交。4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。（三）基因工程的应用 1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。（四）蛋白质工程的概念 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）转录 翻译 专题 2
12、细胞工程（一）植物细胞工程:细胞或细胞器水平的操作 1.理论基础（原理）：细胞全能性 全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞 2.植物组织培养技术（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞(外植体)愈伤组织 试管苗 植物体（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。A 植物繁殖 微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖 作物脱毒：采用茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有）以新的遗传特性创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品基因工程是在分子水平上进行设计和施工的又叫做重组技术操作水平分子原理基因重组一基因工
13、程的基本工具连接酶的比较分子手术刀限制性核酸内切酶限制酶来源的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开因此具有专一性结果经限制酶切割产生的片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端分子缝合针连接酶两种连接酶连接酶和相同点缝合磷酸二酯键区别连接酶来源于噬菌体只能将双链片段互补的同聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端形成磷酸二酯键连接酶是连接两个片段的末端形成磷酸二酯键分子运输车载体载体具备的条件能在受体细胞中复制并稳定保存具有一至多个限制酶切点供外源片段插入具有标人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的
14、限制；方便储藏和运输 B 作物新品种培育 单倍体育种：a 过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab 四种类型）；对花粉进行花药离体培养（技术是植物组织培养）；得到单倍体植株；对其幼苗时期进行秋水仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb 四种类型）。b 优点：明显缩短育种年限 C 突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体）D 细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。（3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育
15、植物新品种的最后一道工序。3.植物体细胞杂交技术（1）过程：注意：核融合标志原生质融合结束 再生壁形成标志着杂种细胞形成 杂种植株形成标志着植物体细胞杂交技术结束 目的：为了获得杂种植株 原理：膜的流动性和细胞全能性（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。（二）动物细胞工程 1.动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。原代培养定义：人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。传代培养定义
16、：当原代培养的细胞处于接触抑制后,用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新的培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养的过程）细胞株：传代细胞一般能传到 40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株 细胞系：传代 50代以后又出现细胞生长停滞状态，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物 质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑 制，容易传代培养。以新的遗传特性创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品基因工程是在分子水平上进行设计和施工的又叫做重组技术操作水平分子原理基因重组一
17、基因工程的基本工具连接酶的比较分子手术刀限制性核酸内切酶限制酶来源的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开因此具有专一性结果经限制酶切割产生的片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端分子缝合针连接酶两种连接酶连接酶和相同点缝合磷酸二酯键区别连接酶来源于噬菌体只能将双链片段互补的同聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端形成磷酸二酯键连接酶是连接两个片段的末端形成磷酸二酯键分子运输车载体载体具备的条件能在受体细胞中复制并稳定保存具有一至多个限制酶切点供外源片段插入具有标（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转
18、入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。（4）原理：细胞增殖（5）动物细胞培养需要满足以下条件 无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。温度：适宜温
19、度：哺乳动物多是 36.50.5；pH：。气体环境：95%空气5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。2.动物体细胞核移植技术和克隆动物（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。卵母细胞培养到减数第二次分裂中期（3）体细胞核移植的大致过程是：（右图）核移植 胚胎移植 （4）体细胞核移植技术的应用：加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；
20、保护濒危物种，增大存活数量；生产珍贵的医用蛋白；作为异种移植的供体；用于组织器官的移植等。（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。3.动物细胞融合（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。以新的遗传特性创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品基因工程是在分子水平上进行设计和施工的又叫做重组技术操作水平分子原理基因重组一基因工程的基本工具连接酶的比较分子手术刀限制性核酸内切酶限制酶来源的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开因此具有专一性结果经限制酶切割产
21、生的片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端分子缝合针连接酶两种连接酶连接酶和相同点缝合磷酸二酯键区别连接酶来源于噬菌体只能将双链片段互补的同聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端形成磷酸二酯键连接酶是连接两个片段的末端形成磷酸二酯键分子运输车载体载体具备的条件能在受体细胞中复制并稳定保存具有一至多个限制酶切点供外源片段插入具有标（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手
22、段。（4）原理：膜的流动性（5）为了获得杂交细胞（6）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：比较项目 细胞融合的原理 细胞融合的方法 诱导手段 用法 植物体细胞杂交 细胞膜的流动性 去除细胞壁后诱导原生质体融合 离心、电刺激、振动，聚乙二醇等试剂诱导 克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株 动物细胞融合 细胞膜的流动性 使细胞分散后诱导细胞融合 除应用植物细胞杂交手段外，再加灭活的病毒诱导 制备单克隆抗体的技术之一 4.单克隆抗体（1）抗体：一个 B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。（2）单克隆抗体的制备过程：（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产
23、生专一的抗体。（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。（5）单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。专题三：胚胎工程 1、精子的发生大体可以分为三个阶段：精原细胞 注入小细胞融合 分离 抗原注入小鼠体内 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 细胞培选择培养细胞 培养基 体内培养 体外培养 从腹水提取 从培养液提单克隆抗体 以新的遗传特性创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品基因工程是在分子水平上进
24、行设计和施工的又叫做重组技术操作水平分子原理基因重组一基因工程的基本工具连接酶的比较分子手术刀限制性核酸内切酶限制酶来源的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开因此具有专一性结果经限制酶切割产生的片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端分子缝合针连接酶两种连接酶连接酶和相同点缝合磷酸二酯键区别连接酶来源于噬菌体只能将双链片段互补的同聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端形成磷酸二酯键连接酶是连接两个片段的末端形成磷酸二酯键分子运输车载体载体具备的条件能在受体细胞中复制并稳定保存具有一至多个限制酶切点供外源片段插入具有标 有丝分裂 分裂，发生在 睾丸曲细精管 。精原细胞（部分精原细胞仍然保持为精
25、原细胞）滋长，完成 DNA 复制和 相关蛋白质 合成，即进行 染色体复制 复制。初级精母细胞（开始 减数分裂 分裂）由 中心体发育 减 I 分裂 次级精母细胞 减分裂 精（子）细胞 这是精子形成 的第三个阶段：精子 精细胞 精子 由细胞质的其他部分发育 2、卵子形成：胚胎在性别分化以后，雌性胎儿卵巢内的 卵原细胞，通过 有丝分裂，不断增加数量，并经 DNA 复制和相关 蛋白质 合成，即 复制，滋长，成为 初级卵母细胞 细胞，这个细胞被 卵泡 细胞包围，成为 卵泡。即雌性胎儿在出生时，已经准备好了所有的 初级卵母细胞（卵泡）。排卵：是指卵子 从 卵泡 中排出，排出时是初级卵母细胞 细胞（马、犬）
26、或者是 次级卵母细胞 细胞（猪、羊）。卵子形成过程中的减数分裂：减数第一次分裂在 排卵前后完成，产生一个 次级卵母细胞 和第一极体，进入 输卵管 ，减数第二次分裂在 输卵管 过程中完成，标志是：在 的间隙可以观察到 二个极体 的时候。3、受精作用 准备阶段：精子准备：精子必需在雌性生殖道 中运行一段时间，称精子获能。在体外受精操作时要人工进行。卵 子 准 备：排 卵 时 排 出 的 是 初 级 卵 母 细 胞 细胞或是 次级卵母细胞细胞，还需要在 输卵管 内进一步成熟，到达 减数第二次分裂中 期，才具有受精能力。受精阶段：高尔基体 细胞核 线粒体 初级卵母细胞 _头 线粒体鞘 _ _放射冠 透
27、明带 卵黄膜 以新的遗传特性创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品基因工程是在分子水平上进行设计和施工的又叫做重组技术操作水平分子原理基因重组一基因工程的基本工具连接酶的比较分子手术刀限制性核酸内切酶限制酶来源的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开因此具有专一性结果经限制酶切割产生的片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端分子缝合针连接酶两种连接酶连接酶和相同点缝合磷酸二酯键区别连接酶来源于噬菌体只能将双链片段互补的同聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端形成磷酸二酯键连接酶是连接两个片段的末端形成磷酸二酯键分子运输车载体载体具备的条件能在受体细胞中复制并稳定保存具有一至多个限制酶切点
28、供外源片段插入具有标 防止多精入卵的两道屏障：在精子触及 透明带的瞬间，发生透明带反应是防止多精入卵的第一道屏障；精子入卵后，发生卵细胞膜反应这是防治多精入卵的第二道屏障。）二、哺乳动物胚胎发育过程（从受精卵到幼体）场所：输卵管、子宫 过程：受精卵 卵裂 桑葚胚 囊胚 原肠胚 胎儿形成 场所：输卵管 子宫 卵裂期：细胞在透明带中进行有丝分裂，数量增加，胚胎总体积不增加，每个细胞体积减小，有机物总量减少。桑椹胚：胚胎细胞达 32 个左右，每一个细胞都具有全能性。之前为全能细胞 囊胚：外表是一层扁平细胞，称为滋养层，滋养层发育成胎膜和胎盘。囊胚中心的腔称为囊胚腔。此期细胞开始分化，腔内一侧的细胞群
29、称为内细胞团，内细胞团将来发育成胎儿各组织。（细胞开始分化的时期）此时期孵化从透明带中孵出 原肠胚：分化成三个胚层，具有原肠腔（“一腔三层”）入卵后的变化 精子穿越_放射冠_和透明带 精子进入卵黄膜_(精)尾部_脱落,形成 雄原核 (卵)完成减,形成_雌原核_ 雄原核、雌原核发育,并融合 形成原核 配子融合 精子核雄原核 顶体反应精子的 顶体 释放 顶体酶，融解 放射冠 和 透明带 。以新的遗传特性创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品基因工程是在分子水平上进行设计和施工的又叫做重组技术操作水平分子原理基因重组一基因工程的基本工具连接酶的比较分子手术刀限制性核酸内切酶限制酶来源的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开因此具有专一性结果经限制酶切割产生的片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端分子缝合针连接酶两种连接酶连接酶和相同点缝合磷酸二酯键区别连接酶来源于噬菌体只能将双链片段互补的同聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端形成磷酸二酯键连接酶是连接两个片段的末端形成磷酸二酯键分子运输车载体载体具备的条件能在受体细胞中复制并稳定保存具有一至多个限制酶切点供外源片段插入具有标