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1、第36讲基因工程考试说明,1 .基因工程的诞生（I ）o2 .基因工程的原理及技术（含PCR技术）（II）3 .基因工程的应用（II）4 .蛋白质工程（I ）5 .实验:DNA的粗提取与鉴定（实验与探究能力）。考点一基因工程的概念及基本操作工具一、基因工程概念的理解别名基因拼接技术或DNA重组技术原理基因重组操作环境生物体外操作水平分子水平结果获得符合人们需要的新的生物类型和生物产品优点克服远缘杂交不亲和的障碍;定向改造生物的遗传性状二、基因工程的操作工具1.限制性核酸内切酶（简称限制酶）来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。作用:识别双链DNA分子的某种特定的核甘酸序列并切开特定部位的两个
2、核甘酸之间的 磷酸二酯键。结果:产生 O连接酶种类 coDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌丁4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端和平末端作用恢复被限制酶切开的两个核甘酸之间的磷酸二酯键种类:、人噬菌体的衍生物、等作用:携带外源DN A片段进入（D有至多个,供外源DNA片段插入其中条用能在细胞中进行,或整合到受体DNA上,I随受体DNA3,B有特殊的,便于DNA分子的筛选【易错辨析】 基因工程用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶、载体。（）在基因工程的操作过程中，利用限制性核酸内切酶进行DNA的水解。（）限制酶识别的序列均由6个核甘酸组成。（）（4）DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。
3、（）质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。（）图12-36-1中的甲和乙分别表示的是EcoRI限制酶和SmaI限制酶的作用不意图，据切点中轴线切点C AATTCCTTAA+ G图分析:黏性末端GIC GIC GIC c:l:c:CIG CIG教材拓展中轴线彻点）图 12-36-1平末端请说出&oR I限制酶和SmaI限制酶识别的碱基序列及切割的位点。以上实例说明限制酶有何特性?O要将图甲中的末端再连接起来,需要用哪类连接酶若连接图乙的末端呢？若质粒运载体用EcoRI切割,为使运载体与目的基因相连，图甲中含有目的基因的DNA除可用EcoRI切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割该酶切割后得到
4、的末 端必须具有什么特点？1 .与DNA有关的酶的比较名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酉每脱氧核或热稳定磷酸二酯键将单个脱氧核甘酸依次连接到单链末端甘酸DNA聚合酶DNA（水解）磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核甘酸酶碱基对之间解旋酶DNA将双链DNA分子局部解旋为单链形成两条长链的氢键RNA号恩合召舞酉爰,口核糖核昔酸将单个核糖核昔酸依次连接到单链末端酶 二酯键2 .限制酶的特点与使用限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核甘酸序列，并在特定的位点上进行切割;
5、限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列 已经被修饰。在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶以获得相同的黏性末端。但如果用两 种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连 接起来。为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处 理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。:典例追踪:“2020,四川攀枝花市二模根据与基因工程有关的知识，回答下列问题： 限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段,其末端类型有 和 O质粒运载体用EcoRI切割后产生
6、的片段为AATTCGGGTTAA，为使运载体与目的基因相连含有目的基因的DNA除可用EcoRI切割外，还可用另一种限制性核酸 内切酶切割，该酶必须具有的特点是 O根据酶的来源不同基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即 DNA连接酶和DNA连接酶。 基因工程中除质粒外,和 也可作为运载体。若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原 因是 O2,2021云南师大附中高三月考图12-36-2中甲、乙分别表示质粒和含目的基因的DNA片 段。几种可供选择使用的限制酶识别序列及其切割位点为EcoR I -G，AATTC;%/77H I :G GATCC目的基因 乙图
7、 12-36-2注:忆表示四环素抗性基因;表示氨羊青霉素抗性基因。回答下列问题: 限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核甘酸序列，并且使每条链中特定部位的 两个核甘酸之间的 断开。题中可供使用的限制酶，切割相应DNA片段后能产生黏性末端的有 0经限制酶3A I切割后得到的DNA片段可以与上述其余限制酶中的（填 限制酶名称）切割后得到的DNA片段连接,理由是。图甲质粒经3A I完 全切割后可得到一种DNA片段。为防止限制酶切割后的DNA片段自身环化，在基因工程中通常使用两种切割后产生不同 黏性末端的限制酶切割同一DNA分子。由此分析,图甲应当使用（填限制酶名称）进 行切割，图乙应当使用（填
8、限制酶名称）进行切割。图甲中的7/和30/在运载体上可作为,用于重组DNA的鉴定和选择。方法归纳选择限制酶的技巧Pst I Sma I Pst I尸sJ1才EcoR T嬴 15nA甲乙图 12-36-3根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst o不能选择切点位于目的基因内部的限制酶如图甲不能选择Sra I。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质 粒，如图甲也可选择用Pst和EcoRI两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。 根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一
9、致以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中 限制酶SmaI会破坏标记基因。考点一基础自主梳理二、1.（3）黏性末端或平末端3.质粒动植物病毒受体细胞限制酶切割位点自我复制进行同步复制标记基因【易错辨析】(l)x (2)x (3)x (4)x (5)x解析基因工程用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。限制性核酸内切酶能将DNA切成两个或多个片段,DNA水解酶能将DNA水解。限制酶识别的序列主要由6个核甘酸组成也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核昔 酸组成。(4)DNA连接酶连接的是磷酸二酯键。载体质粒上抗生素抗性基因可作为标记基
10、因,供重组DNA的鉴定和选择。【教材拓展】Q)&?oR I限制酶识别的碱基序列是GAATTC,切割位点在G和A之间;Sod I限制酶识别的碱 基序列是CCCGGG,切害0位点在C和G之间 限制酶具有专一性连接图甲中的黏性末端既可用coDNA连接酶也可用T4 DNA连接酶，连接图乙中的平 末端只能用T4DNA连接酶该酶切割产生的DNA末端与EcoRI切割产生的末端相同素养全面提升1 .(1)平末端黏性末端切割产生的DNA片段末端与EcoRI切割产生的末端相同(3)T4Ecoli动植物病毒入噬菌体的衍生物未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱解析限制性核酸内切酶倘称限制酶沏割DNA分子后
11、产生的片段末端类型有黏性末端 和平末端。目的基因与运载体具有相同的黏性末端才能连接着用包括EcoR I在内的两种 限制酶切割目的基因，则另一种限制酶必须具有的特点是切割产生的DNA片段末端与EcoRI切割产生的末端相同。根据酶的来源不同,基因工程中所使用的DNA连接酶有两类, 即ooDNA连接酶(来源于大肠杆菌)和T4 DNA连接酶(来源于T,噬菌体)。(4)基因工程中 常用的运载体是质粒，此外还有人噬菌体的衍生物和动植物病毒。由于未处理的大肠杆菌 吸收质粒(外源DNA)的能力极弱，因此若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未 处理的大肠杆菌作为受体细胞，而通常用Ca?+处理大肠杆菌
12、细胞，使其成为感受态细胞,此时大 肠杆菌细胞壁和细胞膜的通透性增大,容易吸收重组质粒。2 .磷酸二酯键 EcoR I、Ba mH I、Bd 、Sau3A I(2)砧OH I、Bd它们切割后产生的片段具有相同的黏性末端3(3)Be/1 和 EcoR I 3A I 和 EcoR I标记基因解析限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核昔酸序列，并且使每条链中特定部 位的两个核甘酸之间的磷酸二酯键断开。题中可供使用的限制酶切割相应片段后都会产生黏 性末端，因此切割相应DNA片段后能产生黏性末端的有EcoR I . BamW I、及:/1、Sau3A I o 经限制酶SauBA I切割后得到的DNA片段可以与题述其余限制酶中的BamWI、8 I切 割后得到的DNA片段连接，理由是它们切割后产生的片段具有相同的黏性末端。图甲质粒有 三个3A I的酶切位点,所以经3A I完全切割后可得到3种DNA片段。为避免限制 酶切割后的DNA片段自身环化，应该用不同的限制酶切割DNA的两端，因此，图甲应当使用 Bd和&oR I进行切割,图乙应当使用3A I和&oR I进行切割。图甲中的amp 都是抗性基因，在运载体上可以作为标记基因，用于重组DNA的鉴定和选择