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1、乳酸菌检测乳酸菌检测方法1 适用范围本方法适用于清谷田园食品系列产品及原料中的乳酸菌的检测。2 设备和仪器2.1 恒温培育箱：3612.2 天平：感量为 0.01g2.3 无菌吸管：1 ml、2ml、10ml2.4 无菌锥形瓶：500ml2.5 无菌培育皿：直径为 90mm2.6 无菌试管：18180mm2.9 酒精灯2.10 立式蒸汽压力灭菌器2.11 超净工作台2.12 厌氧缸3 试剂3.1 无菌生理盐水：称取 8.5g 氯化钠溶于 1000ml 蒸馏水中，121高压灭菌 15min。3.2 MRSMan Rogosa Sharpe培育基3.2.1 成分蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g酵母粉
2、4.0g葡萄糖20.0g吐温 801.0mLK2HPO4.7H2O2.0g醋酸钠.3H2O5.0g柠檬酸三铵2.0gMnSO4.7H2O0.2gMnSO4.4H2O0.05g琼脂粉15g3.2.2 制法：将上述成分加于 1000mL 蒸馏水中，调整 PH 至 6.20.2，加热煮沸溶解，分装于锥形瓶中，在 121高压灭菌 15-20min。3.3 莫匹罗星锂盐Li-Mupirocin和半胱氨酸盐酸盐改进 MRS 培育基：3.3.1 莫匹罗星锂盐贮存液制备：称取 50mg 莫匹罗星锂盐参与到 50 mL 蒸馏水中，用 0.22 mm 微孔滤膜过滤除菌。3.3.2 半胱氨酸盐酸盐贮存液制备：称取
3、250mg 莫匹罗星锂盐参与到 50 mL 蒸馏水中，用 0.22 mm 微孔滤膜过滤除菌。3.3.3 制法5.1.4液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品 25 mL 放入装有 225 mL 生理盐水的无菌锥形瓶瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠中， 充分振摇，制成 1:10 的样品匀液。5.2 步骤5.2.1 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于装有 9 mL 生理盐水的无菌试管中留意吸管尖端不要触及稀释液，振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。5.2.2 另取 1 mL 无菌吸管或微量移
4、液器吸头，按上述操作挨次，做10 倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用 1 次 1 mL 灭菌吸管或吸头。5.2.3 乳酸菌计数5.2.3.1 乳酸菌总数乳酸菌总数计数的培育条件的选择和结果说明如表 1 所示表 1 乳酸菌总数计数的培育条件的选择和结果说明样品中所包括乳酸菌菌培育条件的选择和结果说明属仅包括双歧杆菌属仅包括乳杆菌属仅包括嗜热链球菌按 GB4789.34 的规定执行依据 5.2.3.4 操作。结果即为乳杆菌属总数依据 5.2.3.3 操作。结果即为嗜热链球菌总数同时包括双歧杆菌属和依据 5.2.3.4 操作。结果即为乳乳杆菌属酸菌属总数如需单独计数双歧杆菌属数目， 依据 5.2
5、.3.2 操作同时包括双歧杆菌属和依据 5.2.3.2 和 5.2.3.3 操作， 嗜热链球菌二者之和为乳酸菌总数如需单独计数双歧杆菌属数目， 依据 5.2.3.2 操作同时包括乳杆菌属和嗜依据 5.2.3.3 和 5.2.3.4 操作， 热链球菌二 者 之 和 为 乳 酸 菌 总 数2依据 5.2.3.3 操作。结果即为嗜热链球菌总数3依据 5.2.3.4 操作。结果即为乳酸菌属总数同时包括双歧杆菌属、依据 5.2.3.3 和 5.2.3.4 操作， 乳杆菌属和嗜热链球菌二者之和为乳酸菌总数如需单独计数双歧杆菌属数目， 依据 5.2.3.2 操作依据待检样品活菌总数的估量，选择 2 个3 个
6、连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 1 mL 样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后， 将冷却至 50的 MRS 琼脂培育基倾注入平皿约 15mL，转动平皿使混合均匀。361厌氧培育 48 h2 h，培育后计数。从样品稀释到平板倾注要求在15min 内完成。5.2.3.2 双歧杆菌计数依据对待检样品双歧杆菌含量的估量，选择 2 个3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 1 mL 样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至 50的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐的 MRS 培育基倾注入平皿约 15mL，转动平皿使混合均。361厌氧培育 48 h2 h，
7、培育后计数平板上的全部菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在 15 min 内完成。5.2.3.3 嗜热链球菌计数依据待检样品嗜热链球菌活菌数的估量，选择 2 个3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 1 mL 样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至 50的 MC 培育基倾注入平皿约 15mL，转动平皿使混合均匀。361需氧培育 48 h2 h，培育后计数。嗜热链球菌在 MC 琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径 2 mm1 mm， 菌落反面为粉红色。从样品稀释到平板倾注要求在 15 min 内完成。5.2.3.4 乳杆菌计数5.2.3
8、.1 项乳酸菌总数结果减去 5.2.3.2 项双歧杆菌与 5.2.3.3 项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。5.3 菌落计数可用肉眼观看，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位colony-forming units，CFU表示。5.3.1 选取菌落数在 30 CFU300 CFU 之间、无集中菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不行计。每个稀释度的菌落数应承受两个平板的平均数。5.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜承受，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落
9、数；假设片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。5.3.3 当平板上消灭菌落间无明显界限的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。5.4 结果的表述5.4.1 假设只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 gmL中菌落总数结果。5.4.2 假设有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式1计算：式中： N样品中菌落数；C平板含适宜范围菌落数的平板菌落数之和； n1第一稀释度低稀释倍数平板个数； n2其次稀释度高稀释倍数平板个数； d稀释因子第一稀释度。5
10、.4.3 假设全部稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进展计数，其他平板可记录为多不行计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。5.4.4 假设全部稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5.4.5 假设全部稀释度包括液体样品原液平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。5.4.6 假设全部稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU300 CFU 之间，其中一局部小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。5.5 菌落数的报告5.5.1 菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。5.5.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字承受“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，承受两位有效数字。5.5.3 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。6 结果与报告依据菌落计数结果出具报告，报告单位以 CFU/gmL表示。