中医学综合实验报告.docx

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1、试验报告乙酰苯肼制作小鼠血虚证模型及中药疗效观看小鼠造模、四诊观测及病理局部*血虚证是临床常见的疾病证型之一。血虚证动物模型是探讨该证的实质、争论其病理机制和防治措施的中药途径。本试验选取了造模方简便、结果牢靠的乙酰苯肼制作血虚证模 型，并用传统血虚证治疗方剂四物汤与当归补血汤进展治疗，分析、比较治疗效果的异同。一、材料及方法一 试验材料1. 试验动物造模用清洁级雄性 ICR 小鼠 43 只，体重263g。饲养于内铺垫料的塑料笼，每天自食一般颗粒饲料。2. 仪器及设备SQF-EA 体式显微镜；NIKONCoopix4500 数码相机；自制光源设备；数字 WMY-01 型温度计；MP200B 型

2、电子天平；YLS-13A 大小鼠抓力测量仪；相机三脚架，划有小方格的透亮薄膜纸及改造的小鼠移动笼具等；一次性注射器等；眼科剪：直无勾 10cm、弯无勾 10cm 各 5 把；组织镊：12.5cm 2 把；眼科剪：直尖 10cm4 把；解剖剪：cr/4， 4 把；一般双面刀片：10 片/盒1 盒；染色架：5 个；染色缸：1000ml，14-15 个； 切片盒：50 片/盒3 盒或 100 片/盒2 盒；玻璃漏斗： 90 3 个；玻璃搅棒 2 支； 一般粗孔大张滤纸：20 张； 90mm 玻璃培育皿 4 个；中号一般毛笔 2 支；烧杯： 500ml、1000ml 各 1 个；量筒：100ml、50

3、0ml、1000ml 各 1 个；组织切片机及配套刀片：2 台；摊片用水浴锅：2 台；生物切片石蜡：5 盒，熔点：56-58； 37、60恒温箱：各 1 个；磨砂载玻片：50 片/盒3 盒；盖玻片：100 片/盒2 盒；广口瓶：30ml 或 60ml20 个；滴管及配套吸头：4 个；酒精灯：150ml 4 台；脱水篮： 1-2 个；打火机、标签纸、铅笔各一，卷筒纸，乳胶手套、口罩足量。3. 药物及试剂乙酰苯肼溶液APH，CP，白色粉末状固体，临用时配制成 2%溶液；0.9%氯化钠溶液 500ml*1 瓶；苦味酸2.4.6-三硝基苯酚：30g/瓶1 瓶； 37%-40%福尔马林液：500ml/瓶

4、1 瓶；无水乙醇：AR，500ml/瓶1 瓶；二甲苯: AR，500ml/瓶1 瓶；Hematoxylin 苏木素苏木精： 10g/瓶1 瓶；酸性品红曙红丫水溶： 25g/瓶1 瓶；碘酸钠：AR，500g/瓶1 瓶；柠檬酸：AR，500g/瓶1 瓶；水合氯醛： 250g/瓶1 瓶蛋白甘油甘油/鸡蛋清=1/1：50ml；中性树胶：100 g/ 瓶2 瓶；蒸馏水：500ml二 试验方法1. 动物分组43 只 ICR 小鼠按体重随机分层，分为正常组、模型组、当归补血汤组、四物汤组， 除正常组为 10 只外，其余三组均为 11 只。2. 造模及给药组别 正常组模型组当归补血汤组四物汤组表 1 造模及给

5、药造模及给药第 1、5 天皮下注射与造模等量的生理盐水；第1-7 天每天 1 次灌胃自来水 0.5ml/只皮下注射 2%乙酰苯肼溶液，第 1 天剂量为 0.09ml/10g，第 5 天剂量为 0.05ml/10g， 共 2 次；同时第 1-7 天每天 1 次灌胃自来水 0.5ml/只造模同模型组；第 1-7 天每天 1 次灌胃相应中药水煎液 0.5ml/只造模同模型组；第 1-7 天每天 1 次灌胃相应中药水煎液 0.5ml/只3. 饮水、饮食量自造模之日起，各组动物添加等量的水及饲料，水：500ml/组；饲料：380g/组。4. 检测指标（1） 动物一般状况：主要包括动物死亡状况，动物外观分

6、析，饮水摄食状况等。（2） 四诊计量化指标1) 第 1、8 天各检测 1 次，共 2 次。指标包括体重、腋温、爪尾显微拍照、抓力、旷场等。2) 四诊数据处理:用 Excel 表格建立原始检测数据库，不同日期的检测插入表，形成完整证候演化档案。每张表的“行”为不同组别、各动物及其编号，“列”为各检测内容，及实测值和换算值。包括：体重、抓力、腋温、爪 r、尾 r、水平、直立等。求出正常比照组各指标均数。求出各组小鼠实测值与正常比照组均数的比值，以及各证候程度的值。计算中求出的那些值的各组均数以及标准差，作图并分析，标明有无统计意义。汇总不同日期检测的各组小鼠数据，用以观看证候的进展和演化。3) 证

7、候的计算公式及辨证气盛衰度=各动物水平移动实测值/正常组组均值0.3+各动物直立次数/正常组均值0.2+各动物抓力实测值/正常组均数0.5；辨证标准：与正常组比较，1.5 为气盛，0.75 为气虚，0.5 为气虚甚，0.25 为气亏。阳盛衰度=各动物腋温/正常组组均值0.3+各动物爪r/正常组均值0.5+各动物尾r/ 正常组均值0.2；辨证标准：与正常组比较，1.02 为阳气盛，0.98 阳虚，0.95 阳虚重，0.9 阳损。阴盛衰度=各动物体重/正常组均值；辨证标准：与正常组比较，1.2 为形丰，0.85 为阴虚，0.7 为阴亏，0.6 为液脱。血盛衰度=各动物爪 r/正常组均值0.6+各动

8、物尾 r/正常组均值0.4；辨证标准：与正常组比较，1.1 为血充盈，0.9 为血虚，0.8 为血虚重，0.7 为血亏。（3） 病理切片制作及读片第 8 天处死小鼠，取脾脏和十二指肠固定，常规方法制作病理切片，主要负责脾脏和肠的读片。病理组织切片的制作：a.固定液、染色液的配置；b.组织取材：取肝、脾、胃和十二指肠等脏器； c.固定与修块；d.脱水和透亮；e.浸蜡、包埋与修蜡块； f.切片； g.脱蜡、染色与脱水；h.封片。5. 统计方法计量四诊指标以平均值标准差表示，组间比较承受 SPSS 统计软件进展单因素方差分析ANOVE，组间比较承受 LSD 法得出 P 值，检验标准 p=0.05。二

9、、试验结果一 动物死亡状况试验过程中，共死亡小鼠 21 只，正常组死亡 1 只，模型组死亡 7 只，当归补血汤组死亡 7 只，四物汤组死亡 6 只。二 动物全身状态外观1. 正常组。试验第 5 日，小鼠仍旧较为活泼2. 模型组。试验第 5 日，小鼠消灭少动、扎堆，欠活泼，爪、尾凉。3. 当归补血汤组。试验第 5 日，小鼠消灭少动、扎堆，眯眼，被毛疏松，爪、尾凉。4. 四物汤组。试验第 5 日，小鼠消灭少动、扎堆，眯眼，被毛疏松，爪、尾凉。三 饮水、摄食状况图 1饮水状况图 2摄食状况由图 1、2 可知，正常组的饮水和摄食量均高于其他三组，当归补血汤组、四物汤和模型组相差不大。四 四诊检测1.

10、气盛衰度图 3抓力比较图图 4垂直运动比较图5图 5水平运动比较图图 6气盛衰度由图 3、4、5、6 可知（1） 抓力比较：正常组、模型组、治疗I 组、治疗 II 组的抓力，造模前、后各组间无显著差异 (P0.05)（2） 垂直运动比较：正常组垂直运动明显下降，模型组垂直运动无明显变化，治疗 I 组垂直运动明显上升，治疗 II 组垂直运动下降， 与正常组相比，模型组、治疗 I 组有显著性差异P0.05（3） 水平运动比较：正常组水平运动明显下降，模型组水平运动略有上升，治疗 I 组水平运动明显上升，治疗 II 组水平运功略有下降。与正常组相比，模型组、治疗I 组比较有显著性差异P0.05（4）

11、 气盛程度比较：正常组气盛衰度无明显变化，模型组、治疗 II 组略有上升，治疗 I组则明显上升。与正常组相比，模型组、治疗 I 组有显著差异(P0.05)2. 血盛衰度图 7各组爪r 比较图图 8 各组尾r 比较图图 9血盛衰度由图7、8、9 可知（1） 小鼠爪 r 比较：造模前、后各组间无显著差异(P0.05)（2） 小鼠尾r 比较：与正常组相比，模型组有显著性差异(P0.05图 11各组阴盛衰度比较图由图 11 可知，正常组、模型组、治疗 II 组无明显变化，治疗 I 组明显阴盛。与正常组相比， 模型组、治疗II 组无显著性差异(P0.05)，治疗I 组有显著性差异 P0.05 5. 阳盛

12、衰度图 12各组腋温比较图由图 12 可知，四组腋温均有下降，模型组最为明显。与正常组相比，模型组有显著性差异 (P0.05)图 13阳盛衰度由图 13 可知，正常组、治疗I 组无明显变化，模型组和治疗 II 组明显下降。与正常组相比，模型组有显著性差异 P0.05 ，两组治疗组均无显著性差异(P0.05)6. 同病异证（1） 同样的处理，组内不同个体消灭不同的证候如第 8 天模型组，6 号无证可辨，8 号为气盛证图 14同一个体不同证候由图 14 可知，同一组别中的不同小鼠，其辨证结果也是不同的。（2） 同一个体，存在证候的演化如由第 1 天数据、第 8 条数据可知，治疗 II 组 1 号小

13、鼠明显向气盛证候方向演化图 15同一个体证候演化由图 15 可知，小鼠也会发生证候的演化五 病理读片结果1. 脾图 16正常组脾脏400 倍图 17模型组脾脏400 倍图 18当归补血汤组脾脏400 倍图 19四物汤组脾脏400 倍由图 17 可知，正常组边界清楚，常组脾脏白髓与红髓；由图 17 可知，模型组脾脏上分布着大量含铁血黄素，白髓、红髓边界不清，相互融合，呈现溶血性贫血脾脏病理表现，可见乙酰苯肼造模成功；由图 18 可知，治疗I 组(当归补血汤组)脾脏上分布大量含铁血黄素，白髓、红髓相互融合；由图 19 可知，治疗II 组(四物汤组)脾脏上分布大量含铁血黄素，白髓、红髓边界不清。2.

14、 十二指肠图 20 正常组十二指肠400 倍图 21模型组十二指肠400 倍治疗1组图 22 当归补血汤十二指肠400 倍图 23 四物汤十二指肠400 倍由图 20 可知，正常组十二指肠肠绒毛排列整齐，可见内陷的肠腺由图 21 可知，模型组肠腺数量较少由图 22 可知，治疗 I 组(当归补血汤组)肠腺数量削减由图 23 可知，治疗 II 组(四物汤组)肠腺数量较少。三、争论1. 关于乙酰苯肼造模问题从本次试验来看，造模是成功的。第一组从动物外观上看到，造模第5 天，即消灭爪部颜色变白、眼睛颜色变淡、被毛疏松等转变，本组观测到模型组脾脏病理切片显示，脾脏上有大量含铁血黄素分布，并且白髓与红髓相

15、互融合，边界不清。第三小组观测到模型组肝脏病理切片显示，肝脏上也有大量含铁血黄素分布；其次组的试验室检查中亦觉察外周血中红细胞大小不等，伴有红细胞碎片。三组结果显示， 此次试验血虚证模型造模成功。2. 关于小鼠证候问题证候动物模型是否表达了人体证候的表现特征，这是格外重要的，仅仅以局部的病理损伤、试验指标水平作为模型建立的评价标准，这与中医理论中人体证候的整体、动态、表征等特征相去甚远。本次试验观看了小鼠的体重、腋温、爪尾显微观察、抓力、旷场等四诊指标，试验方法较为客观，可以整体显示小鼠在整个试验过程中证候变化。在本次试验四诊观看结果中，从血盛衰度变化可以看出，除了正常组小鼠变化不大外，其余三

16、组均发生了不同程度的血虚，都有血虚证，以治疗 I 组与 II 组最为明显；从气盛衰度来看，除了正常组小鼠变化不大外，其余三组均发生了不同程度的气盛，治疗I 组最明显；从阴盛衰度来看，治疗I 组发生了显著上升，说明治疗I 组有阴盛证候的演化；从阳盛衰度来看，模型组，治疗 II 组发生了显著下降，说明这两组有阳虚证候。可见，模型组，治疗 I 组，治疗 II 组小鼠除了有血虚证外，还伴有其他证候，此次试验所造的是一个综合性的复合证，并非单一的血虚证。而且， 我们觉察，造模后，小鼠都消灭了腋温降低的现象，伴有明显的阳虚证，在试验观看时，我们觉察小鼠也有同病异证的状况。承受一样的方法造模，之后同样处理，

17、不同的小鼠其证型也会不同，这就提示我们小鼠也有个体化差异，辨证论治在小鼠身上也是可行的。3. 当归补血汤、四物汤疗效问题当归补血汤、四物汤是临床治疗血虚的常用方，此次试验中到底哪个方子的疗效更好呢？首先，从第一组得到的结果可以看出，四物汤在改善血盛衰度方面较当归 补血汤疗效好，且从脾脏病理切片来看，四物汤效果好，但是在改善气盛衰度、阴 盛衰度、阳盛衰度方面，当归补血汤效果好；其次组得到的结果也是四物汤的疗效 好，因其能增加红细胞数量；第三组的结论是支持四物汤，由于血红蛋白检测四物 汤疗效好，而第四组的 PCR 结果也显示四物汤效果好。四组试验结果似乎都在说四物汤治疗血虚疗效好。但是，由于以下缘

18、由，此次试验很难推断哪个方剂更为有效。1.此次试验小鼠的死亡率太高，43 只小鼠死亡 21 只，数据缺失太多，明显影响试验结果。2.正常组小鼠在试验第 5-8 天，体重发生了下降，在正常状况下，小鼠的体重应当是正生长的，正常组小鼠不太好的状态所收集到的结果影响了其他的几组的数 据推断。3.试验时间较为短暂，中药起效较慢，短短的 8 天不肯定能到达中药作用的峰值。4. 血虚证模型四诊观测问题在四诊观测中，抓力、 旷场、拍照过程中 R/G/B 的选择都有不稳定性，如何对四诊观测标准化是急待解决地问题。5. 关于试验误差问题从本次试验中，我们深刻生疏到人的因素在试验中至关重要，试验结果与试验技术亲热相关。如灌胃操作手法不娴熟，直接导致 1 只小鼠死亡；试验过程中遗忘添加某一试剂，使得整个试验缺少局部试验指标的支持。所以，在独立开展试验之前， 我们肯定要练好试验根本功，才能保证明验的圆满完成。