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1、水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增法1范围本文件规定了水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增（recombinase-aid Amplification, RAA）法的试剂材料、仪器设备、检测程序、操作步骤、结果判定和报告、检出限及防 止污染措施。本文件适用于水产品中副溶血性弧菌检测。本文件适用于水产品副溶血性弧菌的快检初筛。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。GB 4789.7食品安全国
2、家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 27403实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3 . 1重组酶介导链替换核酸扩增 recombinase-aid Amplification, RAA一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程，在恒温下（一般为 3742）,进行核酸扩增的技术。4 原理RAA法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程。根据副溶血性弧 菌的特异性基因序列，结合荧光探针检测法对
3、水产养殖及水体中副溶血性弧菌进行判定。经实时荧光RAA 扩增后，根据样品在30 min内是否出现扩增曲线，可判定样品结果。5试剂材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA 酶污染的容器分装。试剂材料有：a）探针和引物根据副溶血性弧菌的特异性基因序列设计探针和弓I物。表1副溶血性弧菌探针和引物致病菌种类引物探针名称序列（51-39目的基因副溶血性弧菌上游引物业FTTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGtlh下游引物血RAGATGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGAexo探针/zPTTACGTT
4、CTTCGCCGCTGACAATCGCTTCFAM-dTTHF ABHQ-dTACAACCACACGAT-SpacerC3b）试剂1） RAA反应缓冲液：20% PEG, 280 mmol/L醋酸镁（MgAc?）。也可采用等效的商品试剂盒。2）冻干酶制剂：1 mmol/L dNTP 90 ng/L 单链结合蛋白、120 ng/L recA 重组酶、30 ng4iL Bsu DNA 聚合酶、30 ng/|iL ExoIIL 100 mmol/L Tricine 20% PEG 5 mmol/L 二硫苏糖醇、lOOng/L 肌酸激酶, 保存于200 HL反应管中。也可采用等效的商品试剂盒。3）阳性
5、对照：副溶血性弧菌标准菌株ATCC17802,或含目的片段的DNA；阴性对照：非副溶血性弧 菌标准菌株，或不含目的片段的DNA；空白对照：无菌水。6仪器和设备包括以下几种：a）荧光检测仪：带有恒温（391 ）扩增功能的荧光检测仪。b） 微量移液器：0.1 |1L-2.5 |1L, 1 |iL-10gL, 2 g L-20 jiL, 10|iL-100 jiL, 20 AL200（1L, 100 piL-l 000 piL,并配备与移液器匹配的吸头。c） 高速台式离心机：离心力212000 g。d）恒温水浴锅或金属浴：100 1。e）天平：感量0.01 g。7 检测程序副溶血性弧菌实时荧光RAA
6、检测程序见图1图1副溶血性弧菌实时荧光RAA检测程序8操作步骤1.1 样品处理和增菌水产品参照GB 4789. 7执行。1.2 细菌模板DNA的制备8. 2.1试剂盒法使用商品化DNA提取试剂盒，吸取适量获得的增菌液，按其说明提取制备模板DNA。9. 2. 2 煮沸法9.1.1.1 吸取10.1获得的增菌液1 mL菌液加入1.5 mL离心管中，10000 g离心1 min,弃上清。9.1.1.2 加入1 mL无菌水，充分悬浮沉淀，10000 g离心1 min,弃上清；9.1.1.3 加入100 .L无菌水混匀后沸水浴（或95 金属浴）10 min,置冰上冷却；9.1.1.4 10000 g离心
7、1 min,上清液即为模板DNA。8. 3实时荧光RAA扩增实时荧光RAA反应体系副溶血性弧菌RAA检测，50 反应体系见表2。表2副溶血性弧菌荧光RAA反应体系组分名称体积（ML）20% PEG12.5 pLtlh-F(Q pmol/L)2.1 pLr/z-R(10 pmol/L)2.1 pLtlh-P( 10 pmol/L)0.6 pLDNA 模板(20 ng/pL)4.0 pLddH2O26.2 pLMgAc2 (280 mmol/L)2.5 pL总量50 pL注：（1） DNA模板量可根据不同样品，具体情况进行调整。（2）将除MgAc2和模板DNA以外的所有成分涡旋混匀，分装混合液至含
8、有冻干酶制剂的200 rL反应管中，轻 柔手弹使冻干粉充分重溶均匀，短暂离心，打开反应单元，向每个反应单元的管盖上加入2.5piLMgAc2,然后 向各反应单元加入适量模板DNA （100 ng）,充分混匀并离心。（3）可使用等效的商品化荧光RAA试剂盒按照其说明书进行检测。8.4 反应条件将反应管置于荧光检测仪中，39c恒温，30 mine在反应过程中实时监测荧光信号。8.5 实验对照检测过程中分别设阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以无菌水替代模板DNA；阴性对照 以非副溶血性弧菌标准菌株DNA作为模板DNA；阳性对照以副溶血性弧菌标准菌株ATCC 17802 DNA 作为模板DNA。
9、9结果判定和报告9.1 质控标准空白对照在30 min内无扩增曲线；阴性对照在30 min内无扩增曲线；阳性对照在10 min内出现典型 的扩增曲线。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。9.2 结果判定样品在30 min内无扩增曲线，可判定样品结果为阴性，可直接报告未检出副溶血性弧菌；样品在30 min内出现扩增曲线，则样品结果为副溶血性弧菌初筛阳性。对于初筛阳性结果，应参见GB 4789.7进行 确证后报告结果。10 检出限本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为gcFU/mL。11生物安全措施按照GB 19489规定执行。12防污染措施防止污染措施应按照GB/T 27403的规定执行。