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1、强化练23基因工程的操作程序1. （2020安徽宣城期末）烟草是有重要经济价值的双子叶植物，易受TMV（烟草花叶病毒）感 染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染。研究人员利用转基因 技术培育出了抗TMV的烟草，操作流程如图所示。皂二I I IaL重绢Ti质粒 RNA DNA目的基因构建导入、屋黑/再生植株一受体细胞（1）过程表示遗传信息流动中的 过程，所需原料为程所需要的工具酶是 （2）大量扩增目的基因可以使用PCR技术，该技术包括变性、复性、延伸三个步骤，变性这一步骤的目的是 o过程最常用的方法是，过程用到的细胞工程技术是（4）过程还需要进行基因工程操作步骤中的,其中
2、，在个体水平 上检验获得的烟草是否抗TMV的方法是 o答案（1）逆转录 四种脱氧核甘酸 限制酶和DNA连接酶（2）使DNA解链（为单链）（3） 农杆菌转化法植物组织培养（4）目的基因的检测与鉴定用TMV感染烟草，观察烟草是 否被感染（或患病）解析（1）由图可知，过程表示以RNA为模板逆转录形成DNA的过程，所需原料为构成 DNA的4种脱氧核甘酸。过程表示构建基因表达载体的过程，需要用同种限制酶或能产生 相同末端的限制酶切割目的基因与载体，用DNA连接酶连接目的基因与载体的末端。（2）PCR 技术中的变性是利用高温使DNA解聚成单链。（3）过程将目的基因导入植物细胞常用农杆 菌转化法，过程受体细
3、胞通过植物组织培养技术得到再生植株。（4）过程从再生植株中筛 选出转基因成功的抗TMV烟草植株还需要进行目的基因的检测与鉴定；其中，若从个体水 平鉴定获得的烟草能否抗TMV,可对转基因烟草接种TMV,观察烟草是否被感染。2. CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是近年来颇受关注的一项新技术。该基因表达系统主要 包含引导RNA和Cas9蛋白两个部分，引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导 Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA,最终实现对靶基因序列的编辑。研究人员试图用 CRISPR/Cas9系统对水稻产量基因。进行基因编辑，请回答下列问题：（1）研究发现，仅存在于原核生物，故需借助
4、 技术才能在水稻细胞中发挥作用。Cas9蛋白与 酶的功能相似。（2）首先依据 的部分序列设计DNA片段A（负责编码相应引导RNA）,再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接，以构建编辑水稻基因。的CRISPR/Cas9系统基因表达载体（如 图所示）。位点I、位点H分别表示 的酶切位点。（3）质粒B大小为kb（位点I与位点II相隔60 b）,经酶切后的片段A大小为kb（千碱基对）, 连接形成的表达载体大小为 kbo （4）常用农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞，依据农杆菌的侵染特点，目的基因将插 入到Ti质粒的 上，经过转化作用，进入水稻细胞，并将其插入到，从而使其得以维持稳定和表达。（5）
5、CRISRP/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶，试从引导RNA的角度分 析脱靶的原因： 答案（1）转基因（或DNA重组或基因工程）限制（2）基因。Kpn I BamH I （3） （4）T -DNA 水稻细胞染色体的DNA上（5）其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序 列，造成引导RNA错误结合而脱靶解析 若将原核生物的C7?/S?/Cqs9导入水稻细胞中发挥作用，需要利用基因工程技术， 根据题干信息“Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA”可知Cas9蛋白与限制酶的功能相 似。（2）根据题意，水稻产量基因。是目的基因，故首先需要依据基因。的部分序列设计DNA 片段A,
6、根据片段A两端的限制酶种类以及片段A连接在位点I、位点H之间，可知位点I、 位点H分别表示即 I和I的酶切位点。（3）质粒B大小为2.5 kb（位点I与位点H相隔 60 b）,经酶切后的片段A大小为0.5 kb,连接形成的表达载体大小为+ =2.94（kb）。（5）由 于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合，从而导致 CRISRP/Cas9基因编辑技术会出现编辑对象出错而造成脱靶。3 .大肠杆菌的质粒上含有/acZ基因，其编码的产物p-半乳糖首酶在X-gal和IPTG同时存 在时，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。如图为利用该质粒进行的 转基
7、因过程，回答下列问题：/EcoR I EcoRi Sma 含目的基%因的DNASma I、EcoR I 酶切自身环化转化 大肠杆菌|转化 大肠杆菌培养基中加入X-gal. IPTG 菌落I EcoR 1酶切添加末端|转化 大肠杆菌7力e培养基中加入X-gaK IPTG培养基中加入X-gal. IPTG菌落菌落在基因工程中，大肠杆菌质粒通常作为，除此以外，基因工程操作还需要 和 两种工具酶。（2）基因工程的核心操作步骤是 o（3）本题中将目的基因导入受体细胞的方法是,目的基因在受体细胞内维持稳 定和表达的过程，称为。（4）加入了 X-gal和IPTG培养基被称为 培养基，能够筛选出含目的基因的菌
8、落是（填“”“”或“”），颜色是 o答案（1）载体限制性内切核酸酶DNA连接酶（2）基因表达载体的构建（3）Ca2+处理法 转化（4）选择白色解析（1）基因工程的四个步骤分别是目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的 基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定，在将目的基因导入受体细胞时，大肠杆菌质粒 通常作为载体；除此以外，在目的基因的筛选与获取、构建基因表达载体时，还需要限制性 内切核酸酶和DNA连接酶两种工具酶。（4）加入Xgal和IPTG的培养基属于选择培养基， 因此加入Xgal和IPTG的目的是将导入重组质粒的大肠杆菌筛选出来。在同时具有X-gal 和IPTG的培养基中，如果大肠
9、杆菌中导入完整的/qcZ基因，则该基因可以控制合成0-半乳 糖甘酶，菌落应该呈现蓝色，否则菌落呈现白色，因此菌落和均呈现蓝色，而菌落呈 现白色。hCla Bgl II EcoR I Cla IJ I-生长激素基因4 .生长激素制剂是治疗侏儒症的特效药。利用基因工程让大肠杆菌合成人类的生长激素，部 分流程如图所示（注/为氨年青霉素抗性基因，加为四环素抗性基因，Ori是复制原点; EcoR I、5g/Ik Cla I表示限制酶）。回答下列问题。组巴二肠选择含重组质粒的a 一杆培养基大肠杆菌 粒 菌（l）EcoRl限制酶识别的碱基序列是GAATTC,该序列中有 个喋吟。切割图中的目的基因时不能选择E
10、coR I限制酶，理由是将重组质粒导入大肠杆菌时，常选用 处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。该状态的细胞具有 的特性。利用标记基因筛选含重组质粒的大肠杆菌时，所用培养基中需添加(填 “氨茉青霉素”或“四环素”)，理由是 O该基因工程所用的大肠杆菌细胞内本身不能携带 基因，否则筛选出的大肠杆菌细胞内不一定有目的基因。答案(1)6该限制酶识别的序列在目的基因中间，会破坏目的基因(2)Ca2+易从周围环 境吸收DNA分子(3)氨革青霉素 重组质粒中有氨苇青霉素抗性基因，而四环素抗性基因 被破坏氨平青霉素抗性解析(1)coRI限制酶识别的碱基序列应为含有6个碱基对的双链DNA片段，根据碱基互 补配对原则，其中共有6个喋吟；图中生长激素基因是目的基因，而该基因中有EcoR I限制 酶识别的序列，使用该限制酶切割会破坏目的基因，故不能选择EcoRI限制酶切割目的基因。 (2)大肠杆菌细胞最常用的转化方法是用Ca2+处理大肠杆菌细胞，改变细胞膜的通透性，使之 成为感受态细胞；该状态的细胞易从周围环境吸收DNA分子。(3)利用标记基因筛选含重组质粒的大肠杆菌时，四环素抗性基因被破坏，而重组质粒中有氨 羊青霉素抗性基因，因此，培养基中应添加的抗生素是氨节青霉素；故为达到筛选目的，该 基因工程所用的大肠杆菌细胞内本身不能携带氯羊青霉素基因。