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1、ICS11.220CCSB4135福建省地方标准DB35/T19952021禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR诊断技术FluorescencequantitativePCRdiagnosisoffowlhydropercardium-hepatitissyndrome2021-08-17发布2021-11-17实施福建省市场监督管理局发布DB35/T19952021目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14疫病概述.15设备、材料和试剂.26样品的采集、保存和处理.27样品中病毒DNA提取.38荧光定量PCR操作步骤.39结果判定.310测序.4附录A（规范性）试剂的配制
2、及引物序列.5附录B（资料性）扩增产物参考基因序列和荧光定量PCR扩增曲线图.6IDB35/T19952021前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由福建省农业科学院提出。本文件由福建省农业农村厅归口。本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心。本文件主要起草人：施少华、陈珍、陈翠腾、叶洪、张体银、郑腾、黄瑜、朱春华、傅光华、程龙飞、万春和、彭春香、刘荣昌、陈红梅、傅秋玲。IIDB35/T19952021禽心包积液-肝炎综合征荧光定量
3、PCR诊断技术1范围本文件规定了禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR诊断技术的设备、材料和试剂，样品的采集、处理和保存，样品中病毒DNA的提取，荧光定量PCR操作步骤及结果判定的技术要求。本文件适用于禽心包积液-肝炎综合征的分子生物学诊断及流行病学监测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1禽心包积液-肝炎综合征fowlhydropercardium-hepatitissyndrome；HHS由禽腺病毒4型引起禽类的以心包积液、肝炎为特点的一种综合征。3.2禽腺病毒4型fowladenovirusserotype4；FAdV-4引起禽心包积液-
4、肝炎综合征的病原。3.3循环阈值cyclethreshold；Ct值荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4疫病概述禽心包积液-肝炎综合征（HHS），最早于1987年发生于巴基斯坦安卡拉地区。目前，该病呈现世界范围分布，多个国家、地区相继报道该病的发生，各地分离到的毒株略有差异，但大多为FAdV-4，且具有很强的致病性。2010年以来，我国多地发生了HHS，并从发病鸡群中分离到FAdV-4。该病主要临床特征为心包充盈，心包内积有淡黄色液体或胶冻样物；肝脏呈现不同程度肿胀，质地较脆、易碎，有出血斑或出血点；肾脏肿大、质地较脆，有的呈现“花斑肾”。该病主要发生于
5、35周龄肉鸡，1020周龄蛋鸡偶有发生，有报道鸭、鹅、鸽及野鸟也可发生该病。发病鸡在4d后开始死亡，死亡期可持续7d10d，发病率和病死率分别为10%30%和20%75%。该病一年四季均可发生，以水平传播为主，也可垂直传播，感染鸡排毒期可长达9周，发病日龄越早，死淘率越高。15.2.10阳性对照：含FAdV-4目的基因片段的质粒DNA（拷贝数2.1310/L）。DB35/T199520215设备、材料和试剂5.1设备5.1.1台式冷冻高速离心机（转速应12000r/min）。5.1.2水浴锅或金属浴。5.1.3微量可调移液器（量程分别为100L1000L、20L200L、2L20L、0.5L1
6、0L）。5.1.4荧光定量PCR仪。5.1.5旋涡混合仪5.2材料和试剂5.2.1棉拭子稀释液：配比按照附录A的A.1。5.2.2组织稀释液：配比按照附录A的A.2。5.2.310%SDS溶液：配比按照附录A的A.3。5.2.43mol/L醋酸钠缓冲液（pH5.2）：配比按照附录A的A.4。5.2.575%乙醇：配比按照附录A的A.5。5.2.6荧光定量PCR检测用引物和探针的序列、使用方法：配比按照附录A的A.6。5.2.7蛋白酶K、Tris饱和苯酚、酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）、无水乙醇：直接购买成品使用。5.2.8ProbeqPCR试剂盒：应与荧光定量PCR仪相配套的探针qPCR试
7、剂盒。5.2.9PCR反应管：与荧光定量PCR仪相配套的PCR反应管。45.2.11阴性对照：Nuclease-freeWater。6样品的采集、保存和处理6.1样品的采集6.1.1棉拭子样品的采样将棉拭子插入咽喉或泄殖腔旋转35次，取出放入盛有1.0mL棉拭子稀释液的1.5mL无菌离心管中。6.1.2组织样品的采集无菌采集病禽有明显病变的肝脏、脾脏等组织。6.2样品保存样品采集后应保存在28条件下，24h内送达实验室。超过24h的应保存在-20条件下，且时间不应超过7d。如需长期保存，须保存在-70-80条件下。6.3样品的处理6.3.1棉拭子样品的处理取出棉拭子样品，于旋涡混合仪上振荡15
8、s，4、5000r/min离心10min，取上清液备用。2DB35/T199520216.3.2组织样品的处理取组织样品，按质量体积比（1:5）加入组织稀释液进行匀浆，转入1.5mL无菌离心管中，反复冻融23次后，4、5000r/min离心10min，取上清液备用。7样品中病毒DNA提取7.1常规方法提取DNA7.1.1取540L上清液，先加60L10%SDS溶液后，再加蛋白酶K至终浓度50g/mL，于旋涡混合仪上混匀15s，置56孵育2h。7.1.2加入等体积Tris饱和苯酚，于旋涡混合仪上混匀15s后，置4、12000r/min离心15min。7.1.3离心后吸取上清液转移至1.5mL无菌
9、离心管（注意不要吸出中间层），加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），颠倒混匀15s，静置5min后，置4、12000r/min离心15min，吸取上清液转至其他无菌离心管中。7.1.4重复7.1.3步骤1次。7.1.5加入相当于上清液1/10体积的3mol/L的醋酸钠缓冲液（pH5.2）、2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀15s，-20沉淀2h。7.1.6于4下12000r/min离心15min后倾去上清液，加入800L75%乙醇溶解沉淀物，置4下12000r/min离心5min后吸尽残余液体；再以75%乙醇溶解沉淀物1次，置4下12000r/min离心5min，吸尽残余液体；置4下1200
10、0r/min离心5s后吸尽残余液体，室温静置5min。7.1.7加入50L灭菌双蒸水溶解沉淀物，冰浴备用。提取的DNA应于2h内进行荧光定量PCR或保存于-20条件下。7.2商品化试剂盒提取DNA病毒DNA的提取，也可采用商品化DNA提取试剂盒提取。8荧光定量PCR操作步骤在PCR反应管中分别加入以下试剂：ProbeqPCRmix10L，引物FAdV-4-F、FAdV-4-R各0.4L，探针引物FAdV-4-P0.8L，模板DNA2.0L，加Nuclease-freeWater至总体积20L，混匀，离心5s。将PCR反应管放入定量PCR仪，扩增反应条件：95预变性2min；95变性10s，60
11、退火30s，共40个循环；最后保存于4。同时，设立阳性对照和阴性对照各至少一个。9结果判定阳性对照有典型的扩增曲线，且Ct值27；阴性对照无扩增曲线，且无Ct值；两者均符合，方可判定检测结果有效，见附录B的B.1。待检样品Ct值32时，且出现典型的扩增曲线，判为FAdV-4核酸检测阳性，见附录B的B.1。待检样品Ct值35时，或无典型的扩增曲线，判为FAdV-4核酸检测阴性，见附录B的B.1。待检样品32Ct值35时判为可疑，应重做；重做时待检样品Ct值32判为FAdV-4核酸检测阳性，待检样品Ct值32判为FAdV-4核酸检测阴性。3DB35/T1995202110测序必要时可对定量PCR产
12、物进行测序，参考序列参见附录B的B.2。4DB35/T19952021附录A（规范性）试剂的配制及引物序列A.1棉拭子稀释液0.01mol/LPBS缓冲液中添加青霉素（10000IU/mL）、链霉素（10mg/mL）、庆大霉素（250pg/mL）和制霉菌素（5000IU/mL），调节pH至7.27.4。A.2组织稀释液0.01mol/LPBS缓冲液中添加青霉素（2000IU/mL）、链霉素（2mg/mL）、庆大霉素（50pg/mL）和制霉菌素（1000IU/mL），调节pH至7.27.4。A.310%SDS溶液称量10g十二烷基硫酸钠，加入90mL灭菌双蒸水，小心搅拌，缓慢加热至水温在25以上
13、使之完全溶解。A.43mol/L的醋酸钠缓冲溶液取800mL水加入408g三水醋酸钠，溶解后用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容到1000mL。A.575%乙醇量取750mL的无水乙醇加入250mL的灭菌双蒸水。A.6荧光定量PCR检测用引物序列荧光定量PCR检测用引物序列为：a)正向引物FAdV-4-F：5-CCCGATCTCAGTCAAATT-3；b)反向引物FAdV-4-R：5-TGCTAAACTTGTAACGGTC-3；c)探针引物FAdV-4-P：5-FAM-AACGACAAAAACACCGCC-MGB-3。荧光定量PCR扩增片段为196bp，引物和探针用双蒸水溶解至10mol/L，
14、保存于-20备用。5DB35/T19952021附录B（资料性）荧光定量PCR扩增曲线图和扩增产物参考基因序列B.1荧光定量PCR扩增曲线图以建立的荧光定量PCR诊断技术对2份阳性样品和2份阴性样品进行检测，同时设阳性对照和阴性对照，结果见图B.1。标引序号说明：I-阳性对照；N-阴性对照；2-阳性样品；3-阳性样品；4-阴性样品；5-阴性样品。图B.1荧光定量PCR扩增曲线图B.2扩增产物参考基因序列选择FAdV-4GDMZ株（GenBank的登录号：MG856954）Hexon基因序列作为参考基因序列：cccgatctcagtcaaattaaactctacaccaacaacaccgccgcgaacgacaaaaacaccgccgtggctaacgccactaccaacttctacttcggcacggtaccctcctacgaaatcgatatcagcgctacccagaggcgcaactttatcatggccaacatcgccgagtatctgcccgaccgttacaagtttagc。6