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1、MALDI TOF MS 病原体鉴定质量保证专家共识基质关心激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorptio n ioni zati on time of flight mass spectrometry, MALDI TOF MS)作为一种兴的软电离质谱技术，由于其具有快速、准确、灵敏、 自动化及高通量等检测特点，已成为一项革命性病原体快速鉴定技术被用 于临床微生物试验室，并将逐步取代常规病原体生化鉴定方法。任何兴 技术应用于临床都需要建立标准的质量保证体系，以确保检测质量。本专 家共识将对开展 MALDI TOF MS 用于病原体鉴定的设施与安全要求
2、、人员 培训与力量评估、MALDI- TOFMS 病原体鉴定过程的质量掌握、检验程序性 能验证等进展建议。设施与安全要求1 风险评估：拟开展 MALDI TOF MS 病原体检测的试验室需在风险评估根底上建立 有效的安全防护策略，包括设备的使用、化学试剂的安全使用和处理丢弃、 感染性病原体和被污染材料的处置等。风险评估包含确定工作流程和鉴定 步骤中可能发生的化学和生物危害，以及降低风险的方法。2 安全防护：任何操作临床病原体样本或病原体的试验活动至少需要在二级生物安 全试验室(BSL 2)中进展。MALDI TOFMS 应安置在二级生物安全试验室内， 同时使用MALDI TOF MS 检测临床
3、病原体样本时除了需考虑生物危害的风 险外还要留意化学试剂的潜在风险。人员培训与力量评估各试验室应具备 MALDI TOF MS 检测过程中涉及的全部操作人员的初 次培训和定期力量评估的程序文件，对涉及的全部操作人员应进展初次和定期至少 6 个月一次的培训以及力量评估，培训考核需遵循制造商的使 用手册或试验室的标准操作规程，培训的内容包括原理方法、信息技术、 仪器维护、结果报告与解释等方面。此外，还应承受一组形态和生化特征 典型的菌株对培训者进展人员比对和/或考核，以确保全部操作者鉴定结果的全都性。通过培训，要求每位操作人员对每种病原体的鉴定结果必需达 到本试验室设定的每种病原体的最小结果阈值。
4、保存全部培训、考核和能 力评估记录。建议 1 对于临床常见细菌非高致病，操作人员的个人防护应按标准 预防要求，其病原体分别培育、蛋白提取及靶板点样时应在生物安全柜内 进展，点样后的靶板转移至MALDI TOFMS 分析过程中也需留意生物安全防护；对潜在的含生物危害二类及以上的高致病病原体如布鲁菌、炭疽杆 菌、鼠疫耶尔森菌等的临床样本，试验室人员应请示医院感染治理部门并 尽量避开培育检测，必要状况下需要在生物安全柜内承受经灭活程序灭活 后再进展质谱分析。建议 2 前期的样本处理过程中将会使用一些有机溶剂如乙醇、甲酸、 乙腈、三氟乙酸和基质液等，这些溶剂具有腐蚀性或可燃性，可引起人体 皮肤黏膜腐蚀
5、、呼吸及循环系统功能紊乱、多脏器损伤，因此在试验的过 程中使用此类有机溶剂试剂时建议有一个良好的通风环境，同时需加强操 作人员的呼吸道、皮肤黏膜尤其是眼面部的个人防护。MALD TOF MS病原体鉴定过程的质量保证质量保证可确保 MALD TOF MS 病原体鉴定结果的准确性和准时性， 其内容涵盖分析前、分析中和分析后。一分析前1 菌株预备：全部菌株均承受颖培育 1648 h的单个菌落，推举细菌承受血琼 脂平板培育，真菌承受沙保罗平板培育，冻存菌株传代两次后使用。2 靶板点样：先将质控菌株/蛋白标准品点在靶板相应孔位，再点待测菌落。点样时 应留意菌量适当、厚度均匀，不行带有琼脂成分。3 加基质
6、液：点样后参加基质液，应自然凉干。4 特别病原体：如分枝杆菌、丝状真菌和诺卡菌等需要通过蛋白提取法进展提取前处 理，包括使用甲酸、乙腈、破壁硅珠管等试剂耗材。具体处理过程建议参 考制造商供给的SOP 进展操作。5 样本预备留意事项：(1)靶板点样参加基质液后，需完全枯燥形成结晶方可进展检测。(2)靶板预备完成后，如为细菌或酵母菌，需在48 h 内完成检测；如为分枝杆菌，需在 4 h 内完成检测；如曲霉菌等丝状真菌，需马上完成检测。(二)分析中一般状况MALD TOF MS 检测可以得到以下几种鉴定结(1)咼置信的鉴定结果； (2)多个鉴定结果，且每个结果的置信度相像；定结果。下，果：(3)无鉴
7、1 结果推断：当 MALDI TOF MS 供给了高置信的结果时，无需对图谱进展检查和复 核； 而当消灭多个鉴定结果或无鉴定时，可能消灭以下问题：(1)低质量的图谱导致无鉴定结果：需检查菌株和试剂耗材的质量、仪器性能状态以及 具体操作环节；(2)图谱质量较好而不符合预期的鉴定、多个鉴定结果或者 无鉴定结果：应检查样本是否分纯、是否污染或数据库不包含待检菌种。2 结果阈值：目前 MALD TOF MS 的结果阈值通常分为两种：一种以置信度为阈值， 置信度90%的单一结果为优质鉴定结果， 60%- 90%且具有多个鉴定结果为低区分结果(需要补充试验进展分类 )，60%为不能鉴定；另一种则以分值为阈
8、值，质谱评分2 分9.5 分的结果可以鉴定到种，1.7 至 2.0 分9.0 9.5分之间可以鉴定到属需要补充试验进展分类 ,1.7分9.0 分为不 能鉴定或可能鉴定到属。三分析后1 结果复核：鉴定结果的复核是分析后质量治理的重要组成局部，是保证检验结果准确的一个重要环节。 MALD TOFMS 鉴定结果为以下病原体时，需通过相应的补充试验进展进一步鉴别。2 仪器维护及保养：依据制造商要求定期进展维护及保养。3 化学试剂：必需使用仪器制造商要求纯度的化学试剂。质量掌握一室内质控建议 3 需血清学试验确认的病原体：大肠埃希菌疑似志贺菌属和大肠埃 希菌0157、沙门菌属等；需要其他确认试验进展鉴定
9、的病原体： 烟曲霉复合群、 黄曲霉复合群、肺炎链球菌和缓症链球菌群等；需要测序鉴定或报告到群：蜡样 芽抱杆菌复合群、洋葱伯克霍尔德菌复合群、鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍 尔德菌、无色杆菌属、弗劳地柠檬酸杆菌复合群和阴沟肠杆菌复合群等。试验室需依据 MALDI TOF MS 制造商的推举及相关治理指南制定质控 程序。依据制造商要求评估质量分析器、相关系统软件和数据库、化学试剂、靶板和用户的操作 靶板点样、有条件时萃取 。1 质控菌株：质控阳性比照菌株种类应依据试验室拟开展的鉴定病原体范围进展选 择，质控菌株可承受制造商建议的标准菌株或经试验室测序等方法确认的临床菌株。全部质控阳性比照菌株进展质
10、控操作时需承受颖培育1648h的单个菌落，推举细菌承受血琼脂平板培育，真菌承受沙保罗平板培育， 冻存菌株传代两次后使用。2 质控操作及频率：依据制造商的 SOP 文件要求，在靶板清洗、基质溶液及标准品溶液配 制后需每次进展阴性及阳性比照的质量掌握，每次病原体鉴定时亦应如此。3 仪器校准：检测前仪器需进展自身校准，校准通过前方可进展后续鉴定。4 阳性比照：使用大肠埃希菌标准菌株ATCC8739鉴定分值必需到达制造商要求； 如使用标准蛋白测试品， 在分子量大于 12 000 以上的区域必需消灭校准峰， 应明确检测到 m/z 13 683 和 16 952 两个峰，确保高分子量端的准确性。5 阴性比
11、照：检测结果应为“No peak found“ 或者“无鉴定结果“。阴性比照需使用空 白试剂，用于排解可能由试剂污染或重复性靶板清洗不当造成的假阳性结果。阴性比照应为任意孔位 当质控结果失控或校准未通过时，应从各环节分析缘由并予以订正。常见缘由包括：质控菌株/蛋白标准品污染、使用错误的质控菌株/蛋白标准品、使用错误的试剂、操作人员的操作失误等。记录分析失控缘由并归 档。假设未觉察上述明显的缘由可重复测定质控菌株/蛋白标准品，结果在控，可直接进展后续检测；假设不能订正，应联系制造商实行相应的措施。二室间质评建议 4 其他质控困株标准困株或阅历证的临床困株，包括革兰阴性杆菌建议米用产气肠杆菌、革兰
12、阳性球菌建议米用粪肠球菌和念珠菌建议承受光滑念珠菌。室间质评：全程参与由组织方供给的室间质评打算。当消灭室间质评 不符时，准时找到失控缘由并订正。保存每次室间质评信息，包括结果反 馈、订正措施等。无第三方组织的室间质评打算时，试验室应定期自行组 织与其他试验室同类检测方法的室间比对。检验程序性能验证MALDI TOFMS 性能验证包括准确度和周密度。通过MALDI TOFMS 和现用方法或参考方法 如测序方法获得的病原体鉴定结果进展比较以实现 准确度验证。准确度验证尽可能包括临床菌株而不限于是质控菌株或标准 菌株。周密度验证应包括全部主要可能存在的变量，如不同的培育基、培 养条件和提取技术，通
13、常用标准菌株或质控菌株进展周密度验证，应评估 批内、批间，操作者之间以及连续几天的重复性或再现性。在适用的状况 下，还应评估病原体MALDI TOF MS 与 LIS 或其他仪器系统之间接口的正 常运行。一适用范围1 试验室引入 SFDA 批准的 MALDI TOF MS 检测系统时，使用前应进 行全面验证。2 试验室使用 MALDI TOF MS 时，假设对病原体种类、试剂、数据库、分析软件和硬件等进展更换或升级以及扩大检测范围谱根底上增加的病原体 后，应进展局部验证。即在原有检测病原建议 5 性能验证符合要求后投入临床常规使用，在设备状态、环境、检测 方法、人员等维持稳定的状况下，可承受文
14、件和数据审核等定期评审分析系统状 态，无需每年实施性能验证。二验证方案MALDI- TOFMS 验证所用菌株按优先挨次依次选择标准菌株、质控菌株 或经参考方法确认的临床菌株，选择的菌种应尽量掩盖MALDI- TOF MS 制造商公布的可鉴定菌谱，包括革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、厌氧困、酵母困、苛养困、分枝杆困等，同时还应掩盖验证本地区、本实 验室以往检出的特别病原体种类。1.全面验证:准确度：常见病原体如革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、酵母菌每种类别至少验证 30 株，厌氧菌、苛养菌、分枝杆菌如开展、丝状真菌如开展每种至少 10 株，并掩盖本地区、本试验室检出的重要病原体。
15、比较 MALDI TOF MS 鉴定结果与试验室现用方法或参考方法法之间的符合率。周密度：选择连续 3 d o如测序方10 株代表性菌株，每天重复检测3 次，2 .局部验证: 见表 1。适用范围扩大病原谱举例补充某一种病原体推举方案准确度：选择 10 株以上该种类病原体，与现用方法或参 考方法如测序方法比较周密度：1 日内重复检测质控菌株 3次试剂种类转变设备重大修理表 1 常见状况下验证方案商品化试剂改为自配试剂更换离子检测器或激光源依据上述方案进展检测性能和 LIS 数据传输验证三可承受标准严格依据制造商使用说明的要求进展结果判读 果阈值0参考环节掌握中的结1.准确度要求:验证的标准/质控
16、菌株符合率应为 100%临床菌株的符合率应在上。90%以2 周密度要求：菌株鉴定结果符合率应为100%。假设未能满足上述验证要求，则MALDI TOFMS 不能通过验证。制造商和/或使用者须实行相应措施，修正后的检测系统应再次进展验证。以上专家共识内容仅限于MALDI TOF MS 用于临床病原体鉴定的质量保证要求，MALDI- TOFMS 作为蛋白质组学争论的支柱技术，在医学及生命 科学领域有更多的应用前景和价值，其他相关领域的应用的质量保证要求 不包括在本次专家共识中。编写组成员编写组成员排名按作者姓氏笔画排序：上海交通大学医学院附属华医院检验科刘瑛；上海交通大学医学院附属仁济医院检验科李敏； 同济大学附属东方医院南院检验科吴文娟；上海交通大学附属儿童医院检验科张泓；上海交通大学附属第六医院检验科汤瑾；复旦大学附属中山医院临床微生物室周春妹；复旦大学附属华东医院检验科赵虎、张艳梅；复旦大学附属华山医院抗生素争论所胡付品；上海市临床检验中心葛平；上海交通大学医学院附属瑞金医院临床微生物科倪语星