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1、猪链球菌2型抗体的检测酶联免疫吸附法1范围本文件规定了猪链球菌2型抗体的酶联免疫吸附 法检测技术操作程序。本文件适用于猪链球菌2型抗体的检测和猪只接 种猪链球菌2型疫苗后的免疫效果评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成 本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用 文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文 件。兽医实验室生物安全技术管理规范（2003年10月 15日农业部第302号公告发布）。3术语和定义结果判定。9注意事项91所有操作应严格遵守兽医实验室生物安全规定；g用于加样的移液器应定期进行校准，以免产生误
2、差 影响检测结果的准确性；9-10倍浓缩洗涤液在低温保存时可能会产生白色结 晶，应加热使其溶解后再使用；一酶标记物溶液和终止液对呼吸道、眼睛及皮肤有刺 激作用，使用过程中应穿戴口罩、护目镜、手套等防 护用具，防止直接接触和吸入；95酶标记物溶液应避光保存，避免与氧化剂接触，盛 装底物溶液的容器应保持洁净；9 6所有试剂均应按照要求进行保存，使用前恢复至室 温；97血清稀释板的微孔只能使用一次。同步进行多板检测时，反应板不宜叠放在37 C温箱中，宜将反应板平放于湿盒内或覆盖封板膜后直接平放于温箱中，但不 宜采用密封袋，避免反应板受热不均。附录A（资料性）溶液的配制A. 1显色液A显色液A按下列配
3、方进行配置：四甲基联苯胺（C/22cl2岫）：0.2g；二甲基亚碉（DMSO） ：8.0mL；加蒸储水：定容至1 000 mL；在800 mL蒸储水中溶解上述各种成份，加蒸储水定容至1 000 mL。 室温保存。A.2显色液B显色液B按下列配方进行配制：磷酸氢二钠（Na2HPOJ ：14. 60 g；柠檬酸（C6H8。7,分析纯）：9. 33 g；0. 75%过氧化氢尿素（CHMO - H2O2） ：6. 4 mL；加蒸储水：定容至1 000 mL；在800 mL蒸储水中溶解上述各种成份，用1 mol/L盐酸调节溶液pH 至5.0,加蒸储水定容至1 000 mL。室温保存。A. 3终止液将27
4、. 8 mL浓硫酸缓慢滴加入300 mL蒸储水中，边加边搅拌，补充 蒸储水至1 000 mL。A. 4 10 X浓缩洗涤液10 X浓缩洗涤液按下列配方进行配制：氯化钠(NaCl) ：8. 0g；磷酸二氢钾(KH2P04) ：0.2g；磷酸氢二钠(N&HPO412乩0) ：2.9 g；氯化钾(KC1) ：0.2g；吐温-20 ：5. 0mL；硫柳汞：0. 1g；蒸镭水：定容至100mL；在80 mL蒸储水中溶解上述各种成份，用1 mol/L盐酸调节溶液pH 至7. 4,加蒸储水定容至100 mL。室温保存。A.5样品稀释液样品稀释液按下列配方进行配制：磷酸盐缓冲液(0. 01 mol/L pH
5、8. 0) ：956. 0 mL；甘油:40. 0 mL；酪蛋白:20.0 g；硫柳汞钠：0. 1 g;吐温-20：1. 0 mL；在956矶磷酸盐缓冲液中溶解上述其余成份。室温保存。A.6磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液按下列配方进行配制：氯化钠(NaCl) ：8.0g；磷酸二氢钾(KH2Po1 ：0.2g；磷酸氢二钠(Na2HP04 - 12H20) ：2.9 g；氯化钾(KC1) ：0.2g；蒸储水：定容至1 000 mL；在800矶蒸储水中溶解上述各种成份，调节溶液pH至8.0,加蒸储水定容至1 000矶。室温保存。下列术语和定义适用于本文件。酶联免疫吸附试验 enzyme-Linked Im
6、munosorbent Assay (ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯 微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相 表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。滴加 底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由 无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。可 通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜 色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。 此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，从而 测定抗体或抗原含量。3 2光密度 Optical Density (OD)测量被检测物吸收掉的光以及有多少光穿过了这个物体。抗原 antigen是指能被免疫细胞识别
7、，使免疫细胞活化发生免疫应答,并能在体内或体外与相应的免疫应答产物（抗 体或效应T细胞）发生特异性结合的物质。3 4抗体 antibody机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞 所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫 球蛋白。4原理在固相载体微孔板上预包被纯化的猪链球菌2型 特异性抗原，当被检血清中含有猪链球菌2型抗体时， 抗体与微孔壁上的抗原形成抗原-抗体复合物，再与羊 （兔）抗猪免疫球蛋白G （IgG）酶标记物反应，最后 通过测定酶作用底物催化后的产物颜色反应判断结果, 检测猪链球菌2型抗体水平。5试剂- -预包被猪链球菌2型抗原的微孔板；血清稀释液；- -猪链球菌2型阳性对
8、照血清；- -猪链球菌2型阴性对照血清；- -羊(兔)抗猪免疫球蛋白G (IgG)酶(HRP)标 记二抗；- -显色液A；- 显色液B；终止液:硫酸(H2S04)溶液(2mol/L)；- -10 X浓缩洗涤液；- 样品稀释液；-商品化试剂盒：可选择同类的商品化试剂盒，比 如猪链球菌2型抗体检测试剂盒。6器材微量移液器（量程10 UL、100 口 L、200 uL、1000 uL）；- -多道可调移液器（量程30300 n L）；- -一次性移液器吸头；- -振荡器；- -酶标仪（含450 nm波长滤光片）；- -37 恒温培养箱或水浴箱；- 100 mL、1000 mL 量筒；- 离心机；-
9、-封板膜；- -一次性乳胶手套、口罩，护目镜；- -吸水纸巾；- -一次性采血器（最大量程5 mL或10 mL）。7试验样品的准备71血液样品采集与处理采血方式为前腔静脉或耳静脉无菌采血。将生猪 绑定好后，用碘酊消毒采血部位，再用75%酒精棉球二 次消毒，最后用脱脂棉球拭干，使用5 mL或10 mL一次 性采血器采集不少于2皿的非抗凝性全血。室温下倾 斜静置2h,待血液自然凝固后，放置2 8 冰箱 中不少于2 h, 4000 r/min离心10 min,使用少00 uL 量程的移液器小心吸出上层血清。7 2血清样品保存与运输血清样品若在分离后一周内完成检测，可置于 2。8 条件下短期保存；若超
10、过一周后检测，应置 于-20 及以下冷冻保存。血清样品运输时，按照兽 医实验室生物安全技术管理规范（2003年10月15日 农业部第302号公告发布）进行样品的生物安全标识, 应用恒温箱加冰袋或干冰密封等方式冷藏运输，运输 时间应尽量缩短，确保血清样品有效。8操作方法“试剂配制将10义浓缩洗涤液恢复至室温，摇匀，然后用蒸 储水或去离子水作10倍稀释，pH调至7. 4。Q样品稀释将已分离好的待检猪血清样品用样品稀释液做 1:10稀释，即取50 uL样品加至！J450 uL样品稀释液中， 并充分混匀。8 3操作步骤8.3.1 酶标板上阴阳性对照和待检样品的分布（见表1）。 在Al、B1加入阳性对照
11、，100 11L/孔;Cl、D1加入阴 性对照，100 2L/孔；El、F1加入空白对照，100 u L/孔;GKH1等其余孔加入稀释好的待检样品，100 U L/孔。表1加样记录表（推荐模式）123456789101112APS3BPS4123456789101112CNS5DNS6EBS7FBS8GS1S9HS2S10注:P一阳性对照孔N一阴性对照孔B一空白对照孔SK S2、S3等一待检样品孔，其余类推。8.3.2 用封板膜覆盖板条，置37。恒温箱或水浴箱中孵 育2h。8.3.3 弃净孔中液体，用力拍干，加入稀释好的洗涤液300 uL/孔，静置Imin后弃净、拍干，如此反复洗板3次。8.3
12、.4 除空白对照外，其余加入酶标记物50 11L/孔，置37 孵育1 ho 8. 3. 5重复步骤8. 3. 3 O8. 3. 6重复步骤8. 3. 3 O8.3.7 加入终止液50 uL/孔，混匀后避光作用10 min, 终止反应后20 min之内，用酶标仪在450 nm波长下测 定0D值。8.3.8 计算S/P值（被检血清0D450 nm值一阴性对照 0D450nm值）/（阳性对照0D450nm值一阴性对照0D450nm值）。R4试验成立条件阳性对照0D450 nm值大于0.6,且阴性对照0D450 nm值 小于0. 3,试验成立；否则，试验不成立，需重新试验。D结果判定8.5.1 如样品S/P值N0. 60时，判为猪链球菌2型抗体 阳性。8.5.2 如样品S/P值0.60时,判为猪链球菌2型抗体 阴性。8.5.3 若采用商品化试剂盒，应根据说明书进行操作及