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1、Optiprep 梯度离心法提取大鼠肝星状细胞的争论戴春蕾;陈少隆;陈黎黎;张伟伟;林镯;陈永平【摘 要】目的 探究 SD 大鼠肝星状细胞(HSCs)的提取方法,观看其生物学特性,为进一步争论它在肝纤维化和免疫应答中的可能机制奠定根底.方法 依次承受前灌注液、0.15 mg/ml 的链霉蛋白酶E 和 0.5mg/ml 的型胶原酶在体原位灌注消化肝脏.肝脏离体剪碎后,在 0.3mg/ml 链霉蛋白酶E、0.3 mg/ml型胶原酶、0.02mg/ml DNA 酶液中 37振荡消化 20min,低速离心(30g,5min)去除剩余肝实质细胞,Optiprep 密度梯度离心法获得纯化的 HSCs.台盼
2、蓝排斥试验评估HSCs 细胞存活率；328nm 紫外光激发 HSCs 自发蓝绿色荧光结合光镜鉴定细胞纯度；-SMA 免疫细胞化学方法鉴定 HSCs;通过光镜观看 HSCs 的形态学变化.结果 本方法,每只大鼠肝脏 HSCs 产量约 8.2106 个,HSCs 存活率在 90以上；原代培育 24h 后,纯度在 85以上；传 1 代后,纯度达 95以上.结论 本方法简洁、经济、有用,可获得较多的大鼠 HSCs.%Objective To establish a practical scheme for the extraction of the hepatic stellate cells (HS
3、Cs) from Sprague Dawley rat, and observe their biological phenotypes, which could lay the foundation for the further study of the possible mechanism of it in liver fi- brosis and immune response. Methods The liver was digested by in situ perfusion of former perfusion solution, 0. 15mg/ml pronage E a
4、nd 0.5mg/ml collagenase in turn. The liver was continued to be cut into pieces and digest using 0. 3mg/ml pronage E, 0. 3mg/ml col-lagenase and 0. 02mg/ml DNage I solution with constant temperature oscillator for 20 min in vitro. After low speed centrifugation being used to remove residual hepatocyt
5、es, cells were treated with density gradientcentrifugation by Optiprep to obtain the purified rat HSCs. Trypan blueexclusion test was used to estimate cell viability. The cell purity was identified by HSCs autofluorescence and light microscopy. The HSCs were identified by immunocytochemical staining
6、 of - SMA. HSCs morphological changes were observed by light microscopy. Results This protocol yielded a preparation of approx 8. 2 10 cells from a single rat liver, with viability over 90% . The purity quotient of HSCs was more than 85% after 24 h of primary eluture and close to 95% after the first
7、 cell passage. Conclusion This method for isolating HSCs is simple, ecnomic and practical, which obtained more rat HSCs.【期刊名称】医学争论杂志【年(卷),期】2023(042)001【总页数】3 页(P142-144)【关键词】肝星状细胞;大鼠;提取;培育【作 者】戴春蕾;陈少隆;陈黎黎;张伟伟;林镯;陈永平【作者单位】325000 温州医学院附属第一医院感染内科/温州医学院肝病争论所;325000 温州医学院附属第一医院感染内科/温州医学院肝病争论所;325000 温州医
8、学院附属第一医院感染内科/温州医学院肝病争论所;325000 温州医学院附属第一医院感染内科/温州医学院肝病争论所;325000 温州医学院附属第一医院感染内科/温州医学院肝病争论所;325000 温州医学院附属第一医院感染内科/温州医学院肝病争论所【正文语种】中 文肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝脏内的一种星状、非实质细胞，位于肝窦内皮细胞与肝细胞之间的 Disse 间隙内。目前认为，在各种导致肝脏损伤的因素作用下，HSCs 被激活，转化为肌成纤维样细胞，发生表型转变，产生细胞外基质及多种细胞因子，最终导致肝纤维化1。有文献报道，激活的 HSCs 的收
9、缩能调整门脉高压中的血管张力2。最近争论说明，HSCs 是强有力的抗原递呈细胞，能激活 NKT 细胞和 T 淋巴细胞，以及能诱导产生对细菌感染的保护性免疫3。因此，争论原代 HSCs 的生物学特性显得很有意义。本争论承受在体原位肝脏灌注结合 Optiprep 密度梯度离心技术成功分别出大鼠原代 HSCs，现报道如下。材料与方法1. 材料来源与仪器设备:(1)试验动物:雄性 SD 大鼠，体重 500100g，购自上海斯莱克试验动物有限责任公司，许可证号为 SCXK(沪)20230005，常规喂养， 自由进食水。(2)主要试剂及仪器:链霉蛋白酶 E(Pronase E)、型胶原酶(Collagen
10、ase)、DNA 酶(DNase)均购自美国 Sigma 公司，DHanks、Hanks 液购自上海索莱宝生物科技。Optiprep 密度梯度液购自挪威 Axisshield 公司。高糖 DMEM 培育基、胎牛血清购自美国 Gibco 公司。小鼠抗大鼠 SMA 单克隆抗体(1100)购自 Sigma 公司，小鼠二步法试剂盒、DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司。倒置相差显微镜购自重庆光电仪器， Axiovert 200 倒置荧光显微镜购自德国 Carl Zesis 公司，高速离心机购自美国Beckman 公司，恒温振荡箱购自上海一恒仪器。(3)分别培育液的配制: 前灌注液:含 05mmol
11、/L EGTA，20mmol/L Hepes，02ml 肝素钠的D Hanks 液 100ml。Pronase E 灌注液:称取 Pronase E 15mg 溶于 100ml Hanks液，参与 20mmol/L Hepes。Collagenase灌注液:称取 Collagenase 50mg溶于 100ml Hanks 液，参与 20mmol/L Hepes。振荡消化液:Pronase E 15mg、Collagenase15mg 和 DNaseI1mg 溶于 50ml Hanks 液。这 4 种溶液均过滤除菌，37预热。终止消化液:DMEM 培育液 12ml，胎牛血清 3ml，4预冷。离
12、心稀释液:高糖 DMEM 培育基添加 025%FBS，20mmol/L Hepes。HSCs 培育液:高糖 DMEM 中添加 10%FBS，20mmol/L Hepes。上述各溶液中均添加100g streptomycin 和 100U/L penicillin。密度梯度离心液:用高糖 DMEM 培育基配制 15%Optiprep 和 115%Optiprep。2. 试验步骤:(1)原位消化:大鼠经 7%水合氯醛 05ml/100g 麻醉、固定、常规消毒后，取十字切口剖腹。暴露肝上下腔静脉、肝下下腔静脉、门静脉主干并分别铺线，结扎门静脉侧支。在门静脉近端剪一小口，置入一次性静脉输液皮管并固定，
13、 用 50ml 注射器推注前灌注液;同时结扎肝上下腔静脉。灌注前灌注液并等肝脏胀至两倍大小时，剪开肝下下腔静脉。当肝外表颜色变为黄白时，依次换用 Pronase E 灌注液灌注 1012min(流速 1520ml/min)、Collagenase灌注液灌注 810min(流速 10125ml/min)。待肝组织完全软化几乎成液体时停顿消化(图 1)。(2)振荡消化及纯化:快速游离下整个肝脏，用 Hanks 冲洗 3 次，放入到盛有振荡消化液的无菌培育皿中，剔除肝包膜和结缔组织，剪碎肝脏。放入 1只 50ml 离心管中，于恒温振荡箱中，200r/min，37振荡消化 20min。完毕后， 参与终
14、止消化液和 Dhanks 液充分分散细胞。然后经 100 目、200 目筛网各过滤 1 次，移入 3 只 50ml 离心管中，550r/min 离心 6min(4)。取沉淀，参与 Dhanks 液补至 50ml，30r/min 离心 5min(4)。取上清，550r/min 离心6min(4)。(3)梯度离心:取沉淀，用 15%Optiprep 5mL 重悬细胞(终浓度为12%)，并依次缓慢上覆 115%Optiprep 5ml 和 Dhanks 液 2ml， 1400r/min 密度梯度离心 20min(4)。轻轻取出离心管，留神吸取115%Optiprep 与 Dhanks 之间的细胞层，
15、依次用 Dhanks 液、离心稀释液，以 550r/min，8min(4)清洗 1 次。(4)细胞培育:用上述 HSCs 培育液重悬细胞，以 1106/ml 细胞密度接种于 25cm2 培育瓶内，于 37、5%CO2 孵箱中培育，24h 后首次换液。此后每 2 天换液 1 次。待细胞长满培育瓶底后，以025%胰蛋白酶001%EDTA 液消化 23min 传代。图 1 胶原酶原位灌注完后肝脏组织形态3. 鉴定方法:(1)HSCs 存活率:台盼蓝排斥试验:把 0.4%台盼蓝 10l 参与到吸取的90l 细胞悬液中，混匀后滴加到载玻片上，静置 3min 后，镜下观看，被染成淡蓝色者为死细胞，而未着色
16、者为活细胞，HSCs 存活率(%)=未着色细胞数/(未着色细胞总数+着色细胞总数)100%。(2)分别的 HSCs 产量的测定:倒置相差显微镜下，承受血细胞计数板法测定细胞产量，HSCs 总数=(4 大格 HSCs 总数/4)104悬液 ml 数，反复测定 2 次，取其平均值。(3)HSCs 的鉴定:在倒置荧光显微镜下，328 nm 紫外光激发细胞自发蓝绿色荧光的即为分别或早期分别的HSCs。在倒置相差显微镜下观看 HSCs 的形态学和生长状态变化。传 1 代后，待细胞爬片后行 SMA 免疫细胞化学染色鉴定。通过 SMA 阳性细胞数计算HSCs 纯度，细胞纯度(%)=SMA 阳性细胞/细胞总数
17、100%。结 果HSCs 的鉴定结果:(1)细胞产量与存活率:10 只 SD 大鼠，体质量 520103958g，HSCs 产量约为 82106 个/只，用台盼蓝染色鉴定，细胞存活率均90%。(2)形态学观看:在倒置相差显微镜下，刚分别未贴壁的 HSCs 呈圆形， 胞质含折光颗粒，体积明显小于肝细胞;在倒置荧光显微镜下呈现蓝绿色荧光，纯度达 85%以上。46h 后局部细胞贴壁，呈椭圆形，少量细胞开头伸出伪足。培育 24h 后，大局部细胞贴壁，开头伸展生长(图 2A)，90%以上的细胞在倒置荧光显微镜下可观看到极易淬灭的蓝绿色荧光。培育至 45 天，细胞呈典型的星形或多边形或纺锤形，内含大量脂滴
18、(图 2B 和 C)。培育 7 天后，HSCs 已充分开放，体积明显增大，胞质内颗粒显著削减，细胞渐渐融合，呈集落生长(图 2D)。培育至 1114 天，细胞由集落生长转为单层生长，铺满培育瓶底，细胞呈典型的肌成纤维细胞样形态，胞质内脂滴消逝(图 2E)。(3)SMA 免疫细胞化学染色:分别的肝星状细胞 SMA 染色阴性;传 1 代后(P1)，SMA 阳性细胞数95%(图3)。讨 论目前国内外不同学者关于大鼠 HSCs 提取的方法报道较多46，但多承受原位灌注肝脏和密度梯度离心相结合的方法。因此，建立简洁、经济、便捷的 HSCs 提取技术，对争论其在肝纤维化和免疫应答中的可能机制具有重要意义。
19、我们经过屡次实践成功提取出 HSCs，并总结出影响 HSCs 提取的主要因素，如下述:图 2 HSCs 形态学观看 A48h(250);B4 天(100);C4 天自发免疫荧光(100);D7 天呈集落生长(250);E11 天呈成纤维样细胞形态(250)图 3 P1 4 天行 SMA 免疫细胞化学染色 A100;B400 1大鼠的体重:一般选择体重大于 350g 的大鼠;本争论选用 400g 以上且小于600g，养分条件较好的大鼠。2. 原位灌注及灌流速度:门静脉插管留意要快、准，避开凝血，切忌插管过深，一方面避开穿破肝脏，另一方面能确保每个肝叶的良好灌注;从插管成功到原位灌注的时间把握在
20、2030min 内。前灌流时速度应较酶灌注时要快，且前灌注液中添加 EGTA，有利于快速冲洗出肝脏内的血液和 Ca2+等;酶灌注的速度稍慢，有利于酶液和肝脏的充分接触，利于消化;我们承受注射器手工静脉推注利于掌控灌流压力及灌流速度。在整个灌流过程中，避开空气进去形成栓塞，导致肝脏灌注不充分。局部循环不良处，可用棉签轻轻触摸改善循环。另外，尽可能结扎肝脏周边的侧支 循环，以削减灌注时酶液的丧失。3. 单细胞悬液的制备:HSCs 易与肝脏中其他细胞间发生黏附，导致细胞产量降低，因此在低速离心前，单细胞悬液的制备，对于 HSCs 的纯化格外重要。消化过程中， 肝实质细胞的破坏会释放大量的 DNA，增
21、加细胞间的黏附。本争论使用 DNase 体外消化 20min，尽可能消退释放的 DNA，削减细胞黏附。在梯度离心前，额外添加 DHanks 液，补满离心管至 50ml，重悬细胞 23min，利于形成单细胞悬液。另外，承受的离心稀释液，有利于细胞代谢及削减细胞的损伤与黏附现象。4酶及酶浓度的选择:承受肝脏在体原位 Pronase E 和 Collagenase连续非循环灌注，结合体外振荡消化的方法，胶原酶浓度较文献上报道的 1mg/ml 低，削减了酶的用量，又易于把握消化的程度。Pronase E 能选择性消化肝实质细胞，浓度较低，对 HSCs 不会有太大的的损伤，再用 37振荡消化 20min
22、 加低速离心法去除剩余的肝实质细胞的方法，提高了 HSCs 的纯度及产量。5梯度离心介质的选择:目前较常用的梯度离心介质包括 Percoll、Nycodenz 和Optiprep。本争论承受 Optiprep，为无菌液体，操作简便，仅需按说明书稀释即可使用，更易于准确把握浓度并提高细胞纯度与产量。6削减杂细胞的干扰:取下肝组织时，应尽可能剔除肝包膜和结缔组织，削减了成纤维细胞和内皮细胞的混杂。同时承受 15%、115%Optiprep 和 DHanks 3 层介质，以保证能形成明显的细胞条带。在梯度离心前，需将离心机设置成慢刹车状态，避开快速制动后层面发生混杂 ;在梯度离心后，须缓慢垂直吸取界
23、面细胞层， 尽量少吸取界面下的 Kuffer 细胞。HSCs 提取成功的关键，在于整个操作步骤的娴熟和操作时间的缩短。本争论合理改进了提取的细节，降低了酶的用量，灌注更加充分、均匀，且方法简洁、经济、有用，细胞产量及成活率较高。参考文献【相关文献】1 Friedman SLLiver fibrosis from bench to bedsideJJ Hepatol，2023，38(Suppl 1):S38 532 Reynaert H，Thompson MG，Thomas T，et alHepatic stellate cells:role in microcirculation and pa
24、thophysiology of portal hypertension JGut，2023，50(4):571- 5813 Winau F，Hegasy G，Weiskirchen R，et alIto cells are liver resident antigen presenting cells for activating T cell responses JImmunity，2023，26:117 129 4 Weiskirchen R，Gressner AMIsolation and culture of hepatic stellate cellsJMethod Mol Med，2023，117:99 1135 丁芹，顾琳，杨绍基，等SD 大鼠肝脏星状细胞分别培育及方法的改进J有用医学杂志2023，23(18):283028326 张强，陈曦，苏畅，等小鼠肝星状细胞的分别、培育及鉴定方法 JJ Surg Concepts Pract，2023，14(1):46 48