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1、 GB 4789.22010前 言本标准代替GB/T 4789.2-2008食品卫生微生物学检验菌落总数测定。本标准与GB/T 4789.2-2008相比，主要修改如下：修改了标准的中英文名称；修改了菌落总数计算公式中的解释；修改了培养基和试剂；删除了第二法菌落总数PetrifilmTM测试片法。本标准的附录A是规范性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB 4789.2-1984、GB 4789.2-1994、GB/T 4789.2-2003、GB/T 4789.2-2008。I GB 4789.22010食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定1 范围本标准规定了食品中菌落总
2、数（Aerobic plate count）的测定方法。本标准适用于食品中菌落总数的测定。2 术语和定义2.1 菌落总数 aerobic plate count食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培养箱：361，301。3.2冰箱：25。3.3恒温 461。水浴箱：3.4天平：感量为 0.1 g。3.5均质器。3.6振荡器。3.7无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10 mL（具 0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。3.8无
3、菌瓶：容量 250 mL、500 mL。3.9无菌培养皿：直径 90 mm。3.10 pH计或 pH比色管或精密 pH试纸。3.11放大镜或/和菌落4 培养基和试剂锥形计数器。4.1平板计数琼脂培养基：见附录 A中A.1。4.2磷酸盐缓冲液：见附录 A中A.2。1 GB 4789.220104.3 无菌生理盐水：见附录A中A.3。5 检验程序菌落总数的检验程序见图1。检样25 g(mL)样品+225 mL稀释液，均质10倍系列稀释选择 2个3个适宜稀释度的样品匀液，1 mL分别加入无菌各取培养皿内每皿中加入15 mL20 mL平板计数琼脂培养基，混匀361 48培 养 h2 h计数各平板菌落数
4、计算菌落总数报 告图1菌落总数的检验程序6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取8000 r/min10000 r/min 均质1 min2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均1 min2 min，制成1:10的样品匀液。6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，质器拍打2 GB 4789.220106.1.3用 1 mL无菌吸管或微量移液器
5、吸取 1:10样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100的样品匀液。6.1.4按 6.1.3操作程序，制备 10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1次 1 mL无菌吸管或吸头。6.1.5根据对样品污染状况的估计，选择 2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行 10倍递增稀释时，吸取 1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6.1.6及时将 15 mL20 mL冷却至
6、 46的平板计数琼脂培养基（可放置于 46 1恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。6.2 培养6.2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，361培养 48 h2 h。水产品 301培养 72 h3 h。一薄层6.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按 6.2.1条件进行培养。6.3 菌落计数可用肉眼观察形成单位（colony-forming units，CFU）表示6.3.1选取菌落数在 30 CFU300 CFU之间、无蔓延平板记录具体菌落数，大于 300 CFU的可记录为多，必要时用放大镜或菌落
7、计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落。菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU的不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。7 结果与报告7.1 菌落总数的计算方法7.1.1若只均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总7.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围
8、内时，按公式有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平数结果。（ 1）计算：C（1）N =(n + 0.1n )d12式中：N样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。3 GB 4789.22010示例：稀释度1:100（第一稀释度）1:1000，244 33（第二稀释度）菌落数（CFU）232，35CN =(n + 0.1 )n d12232 + 244 + 33 + 35 =544=2 + (0.12)102 0.022 = 24727上
9、述数据按7.2.2数字修约后，表示为25000或2.5104。7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算
10、。7.2 菌落总数的报告7.2.1 菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。7.2.2 菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2位数字，后面用 0代替位数7.2.3 若所有平板上为7.2.4 若空白对7.2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体；也可用 10的指数形式来表示，按蔓延菌落而无法计数，则此次检测结果无效。积取样以CFU/mL 为单位报告。“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。报告菌落蔓延。照上有菌落生长，则4 GB 4789.22010附录A（规范性附录）培养基和试剂A.1 平板计数琼脂（plate count
11、 agar ，PCA）培养基A.1.1 成分胰蛋白胨酵母浸膏葡萄糖5.02.51.0ggg琼脂15.0 g1000 mL蒸馏水pH 7.00.2A.1.2 制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 高压灭菌15 min。A.2 磷酸盐缓冲液A.2.1 成分磷酸二氢钾（KH2PO4）蒸馏水34.0 g500 mLpH 7.2A.2.2 制法贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节冰箱。适宜容器中，121高压灭菌15 min。A.3 无菌生理盐水A.3.1 成分氯化钠8.5 g蒸馏水A.3.2 制法1 000 mL称取8.5氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121高压灭菌15 min。5