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1、菌落总数检测的注意事项与快速检测技术引言食品安全事件的频频发生，使得民众对食品安全问题越来越 关注。为了确保食品安全，政府部门除了要出台相关法律法规 外，更为重要的是要建立起更为科学的食品安全性的检测技术。 规范的检测方法是有效保障食品安全的重要环节，它要求检验数 据具有更高的准确度和可信度。食品中菌落总数反映了食品在生 产过程中的卫生情况，体现食品被细菌污染的程度，是做出科学 卫生评价的重要指标之一。一、传统检测方法1 .传统检测方法的流程图2 .注意事项国标法测菌群总数是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合 后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础 的。由于检验中采用36。于有氧
2、条件下培养（空气中含氧约20 %）,因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数，厌氧 菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一 些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养 琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。国 标法检测应注意以下问题：2.1 所用器皿及稀释液2. 1.1检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是 完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。2. 1.2用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。如果在琼 脂对照平板上出现几个菌落时，要追加对照平板，以判定是空白 稀释液，用于倾注平皿的培养基，还是平皿吸管或空气可能
3、存在 的污染。2. 1.3检样的稀释液虽可用灭菌盐水或蒸储水，但以用磷酸缓 冲盐水特别是0. 1%蛋白陈水为合适，因蛋白脓水对细菌细胞有更 好的保护作用，不会因为在稀释过程中而使食品检样中原已受损 伤的细菌细胞导致死亡。如果对含盐量较高的食品（如酱品等）进 行稀释，则需采用蒸储水。2.2样品稀释检样稀释时，无菌称取（或量取）有代表性的样品25g（或 ml）剪碎放于含有225ml灭菌稀释液的玻璃瓶内（瓶内预置适当数 量的玻璃珠），经充分振摇作成L10的稀释液。制备10倍系列稀 释的样品匀液时，每一步都应该摇匀试管，使菌体能够尽量分散 均匀。如系肉、鱼等固体样品，最好剪细于灭菌乳钵内与稀释液 研匀
4、，或与稀释液同置于灭菌均质器杯中，以8000T0000rpm速 度搅拌1分钟，使做成均匀的1： 10稀释液。对于像食醋或酸性 饮料等酸度较高的样品，如果直接用原样液来检测菌落总数，结 果会偏低甚至为0,只有严格按标准要求先用灭菌的20-30%碳酸 钠溶液将其PH值调至中性后方可准确检测出菌落总数。2. 2. 2根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，将上 述1： 10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。即取 1： 10稀释液1mL与9mL稀释液混和做成1:100的稀释液，然后依 次递增稀释，做成1： 1000、1： 10000等稀释液。注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸
5、管或吸头，这样所得检样的稀 释倍数方为准确。从吸管筒或枪头盒内取出灭菌吸管或吸头时，不要将吸 管或吸头尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；;而且吸 管或吸头在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时，也不要触及瓶口 及试管口的外侧部分；因为这些部分都可能接触过手或其他沾污 物。2. 2. 4在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低 于液面2. 5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖 端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸。管内液体调 至所要求的刻度，这样取样较准确，而且在吸管从稀释液内取出 时不会有多余的液体粘附于管外。2. 2. 5当用吸管或吸头将检样稀释液加至另一装
6、有9mL空白稀 释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以 防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。2. 3平板接种与培养2. 3. 1将稀释液加至灭菌平皿内时，应根据食品卫生标准要求 或对标本污染情况的估计，选择13个适宜稀释度，分别在作10 倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液加入 皿内（从皿侧加入，不要揭去皿盖），最后将吸管直立使液体流 毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。 每个稀释度应作2个平皿。2. 3. 2培养温度，应根据食品种类而定。一般的食品如肉、 乳、蛋类等均是用362培养，培养时间为482h；水产品用3CTC 培养，培养时
7、间为723h；培养温度和时间之所以有这种不同的 区分，是因为水产品因来自淡水或海水，水底温度较低，因而制 定水产品细菌方面的卫生标准时，系用3（rc作为培养的温度。2. 4菌落计数2.4. 1在进行菌落计数时，有一些样品的残渣会在视觉上与菌 落混淆，因此，在进行计数时应该仔细分辨。菌落的形状相对规 则，比较有光泽度，更饱满，而样品的残渣比较不规则，没有菌 落的饱满度和光泽度。另外，还可向培养基中添加一定浓度的 TTC,可以使菌落成红色，便于观测和计数，但TTC的浓度不宜过 高，否则会抑制菌落的生长。2.5. 2从温箱内取出平皿进行菌落计数时，应先分别观察同一 稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个
8、平皿内平板上菌落生长情 况。平行试验的2个平板与菌落数应该接近，不同稀释度的几个 平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比，即检样稀释倍数越 大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。2.6. 3菌落计数所得结果，可分别按以下几种不同情况作报 告。2.7. 3.1若只有1个稀释度的平均菌落数在30300之间，则 将该稀释度的菌落数乘其稀释倍数报告之。2.8. 4. 3. 2若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之 间，按式（1）计算。2. 4. 3. 3若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释 度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。2. 4. 3. 4若所有稀释度的平均菌落数均小于3
9、0,则应按稀释 度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。二、快速检测新技术1.3M测试片快速分析技术1. 13M测试片快速分析技术概念3M测试片法是一种便捷可再生水化干膜，适用于细菌和真菌 的计数。1.2 检测步骤只需三步就可实现快速准确的测定。（以大肠杆菌的为例）1.3 结果判读测试片中含有一种红色指示染剂可使菌落着色，计算所有 红色菌落（不论其大小和颜色深浅均计算之）。测试片上没有任何菌落生长。有不多的菌落。测试片菌落数适宜计数范围是25-250o测试片面积约为20平方厘米，当菌落数超过250个，如5 所示，为了估计菌落数，可选择其中一个或数个有代表性菌落的 小方格（心痛），计算平均菌落数，
10、再乘以20可得到整个测试片上 的菌落数。测试片上菌落太多而无法计数。有很多高数量菌落，使整个生长区变粉色，应计录为菌落 太多无法计数。有时菌落分布出现不均衡，这也记录为菌落太多无法计数。测试片上的菌落，最先粗略一看是可计数的，然而，你密切 注意到生长区边缘，能看到高密度的菌落，应记录为菌落太多无 法计数。1. 4测试片法特点1.4. 1工作效率的极大提高根据大量数据统计，使用3M测试片技术，可以提高实验室工 作效率118%以上。劳动资源的最佳使用带来生产能力的提高，最 终的效果就是效益的增加。1 . 4. 2标准化的检测方法品质稳定的快速测试片克服了传统的测试方法存在的由于使 用不同批次的培养
11、基，不同的配制条件，不同配制人员而导致的 差异性。2 .4.3国际化的认证方法3M快速测试的方法得到包括AOAC, AFNOR在内的国际权威机 构的认证，在全球许多国家也已获得官方机构的正式批准，从而 可以确保检测结果的可靠性和在世界各地的广泛认可。1.4 . 4快速得到检测结果对比传统的测试方法，3M快速测试片缩短检测时间，使您在 更短的时间内获得样品的测试结果，能更加迅速地采取有效的措 施解决发现的问题。方便进行HACCP认证由于检测速度快，检测项目全，准确性高。3M为食品生产工 艺过程中关键控制点的监控提供了较为完整的系列产品，可以对 包括生产线，生产设备和环境在内的各个环节进行全面的测
12、试。2. ATP 法2. 1ATP荧光法检测总菌落数原理萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光 能的生物催化剂一荧光素酶、虫荧光素(D-luciferin)以及所有细 胞生物都产生的生物能量物质一三磷酸腺昔(ATP) o在有氧的条 件下，虫光素酶催化虫荧光素和ATP之间发生氧化反应，形成氧 化荧光素并发出荧光，其生化反应式如下：3. 2ATP法特点：2. 2.1具有成本低，操作简单，响应速度快等特点，2. 2. 2微生物ATP生物发光法在国外已被广泛地运用于食品中 菌落总数的测定。3. MTT 法3. 1MTT法检测原理检测原理为活体微生物线粒体中含有琥珀酸脱氢酶，能使外 源性M
13、TT (嘎唾蓝)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲朦(Formazan) 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。Formazan结晶形成的量与 活菌数成正比。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收 值，可间接反映活菌细胞数量。3. 2应用实例：巴氏消毒奶中活菌素快速检测取巴斯消毒奶10mL,至于无菌离心管中300(kpni离心5分钟，弃去上清。加入10mL无菌生理盐水洗涤离心管，再次 3000rpni离心5分钟，弃去上清取出奶液基质。加入1mL生理盐水 重悬底部的微生物，取0.2mL到96孔酶标板中，同时加入标准菌 液做标准曲线，统一加入底物反应30分钟，读数。3. 3该方法的特点：检测快速，灵敏度高。4.流式细胞术4.1 流式细胞术检测原理检测原理：细胞经特异荧光素标记后，通过激光照射，产生 特异荧光信号，通过对这些荧光信号的检测和定量计算出菌群总 数。4. 2特点：快速、便捷结果可靠、便于操作。结语：菌落总数是微生物检测中最常见的项目，在检验的每一个环 节都应该小心谨慎，精准操作，确保检测结果的准确度。国标法 采用的平板计数法是我们最常用的检测方法，但是操作过程较为 复杂，时间较长；而其他方法操作简便，省时，但是有的成本相 对较高，并且有的只针对特定的食品种类。我们应该积极关注新 的科学技术在检测方法中的应用，让检测更加精确、经济、便捷 和可靠。